In Vivo Imaging эффективности трансдукции сердечного таргетинга пептида
Summary
Мы описываем протоколы для оценки степени трансдукции с помощью клеточно-проникающих пептидов с использованием ex vivo систем визуализации с последующим парафином встраивания, сечения, и конфокальной флуоресцентной микроскопии с использованием сердечного таргетинга пептид в качестве примера. В нашем протоколе, одно животное может быть использовано для приобретения обоих типов визуализации оценки одних и тех же органов, тем самым сокращая количество животных, необходимых для исследований в два раза.
Abstract
С момента первоначального описания доменов трансдукции белков, также известных как клеточные проникающие пептиды, более 25 лет назад, наблюдается большой интерес к разработке этих пептидов, особенно клеточных, как новых векторов для доставки диагностических и терапевтических материалов. Наша прошлая работа с участием фагового дисплея определила новый, ненасытно происходящих, 12 аминокислот длиной пептид, который мы назвали сердечной ориентации пептид (CTP) из-за его способности транснавировать нормальную сердечную ткань in vivo с пик поглощения видели всего за 15 мин после внутривенной инъекции. Мы провели подробные исследования биораспределения путем введения CTP помечены фторфора цианин5.5, что позволяет ему циркулировать в течение различных периодов времени, и эвтаназии, фиксации и сечения нескольких органов с последующим флуоресцентной микроскопии изображений. В этой публикации мы подробно описываем эти процессы, а также ex vivo-изображения собранных органов с помощью системы визуализации in vivo. Мы предоставляем подробные методологии и практики для проведения трансдукции, а также исследования биораспределения с использованием CTP в качестве примера.
Introduction
Мембрана плазмы клетки полупроницаемый барьер который необходим для герметичности клетки и выживания и служит для того чтобы отрегулировать внутреннюю часть клетки путем контролировать движение веществ в клетку. Хотя он имеет жизненно важное значение для выживания, он также представляет собой препятствие для доставки груза в ячейку. В 1988 году транс-активатор транскрипции (Tat) белка вируса иммунодефицита человека было показано, чтобы войти в культивируемые клетки и способствовать вирусному экспрессии генов1,2, с доменами, ответственными за эту трансдукции ограничивается аргинин и лизин богатых 13-амино кислотной области третьей спирали3 Эти были названы клетки проникающих пептидов (CPPs). За этим последовали исследования, показывающие способность пептида Tat нести функциональные q-galactosidase в несколько типов клеток4. С момента первоначального описания количество клеточно-проникающих пептидов резко возросло. Эти трансдукции доменов являются естественными или синтетические короткие пептиды, как правило, 6-20 аминокислот в длину, которые способны перевозить функциональные грузы через клеточные мембраны. Эти грузы могут варьироваться от других небольших пептидов, полнометражных белков, нуклеиновых кислот, наночастиц, вирусных частиц, флуоресцентных молекул и радиоизотопов5. Первоначальные CPPs описаны не были клеточной конкретной, с Tat принимаются несколько типов клеток и даже пересечения гематоэнцефалический барьер4, следовательно, ограничивая его терапевтический потенциал. Для того, чтобы определить ячейки конкретных CPPs, следователи предприняли фаг дисплей с использованием больших, коммерчески доступных библиотек фагов6. Наша собственная работа с использованием комбинаторных in vitro и in vivo фаговая методология привела к идентификации CPP имени сердечного таргетинга пептида (CTP)7, 12-аминокислоты, ненатурически происходящих пептид (NH2-APWHLSS-ISRT-COOH), что цели сердца с пиковым поглощением на 15 мин после периферийной внутривенной инъекции8. Используя иммунофлюоресцентный колокализацию с актином, внутриклеточным маркером, и исключение ламинина, маркера мембраны клетки, мы показали что CTP интернализирован в кардиомиоциты мыши после внутривенной инъекции7. Кроме того, мы инкубировали человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных избиения кардиомиоцитов с двойной этикеткой CTP, помечены 6-carboxyfluorescein на его C-термин и родамин на его N-термин через эфир связи, которые могут быть только расщепляется на внутриклеточных эстерас. Быстрое накопление родамина в избиение кардиомиоцитов наблюдалось в течение 15 мин на конфокальной микроскопии8.
В этой статье мы представляем две бесплатные методологии, которые могут быть использованы для отслеживания биораспределения и подтверждения тканевой интернализации CPPs с использованием CTP в качестве примера. Для этих методологий, CTP был синтезирован, флуоресцентно помечены на N-термин с cyanine5.5 (CY5.5), и amide-capped на C-термин для большей пептидной стабильности. Двумя используемыми методологиями являются флуоресцентные оптические системы визуализации vivo и флуоресцентная микроскопия секций тканей. Оба метода очень полезны в изучении биораспределения, поглощения и ликвидации флуоресцентно помеченных CPPs. Преимущество оценки биораспределения с использованием этих методов по сравнению с другими, такими как однофотонная эмиссионная томография (SPECT) или позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), заключается в том, что нет необходимости в трудоемкой радиомаркировке КПП по сравнению с флуоресцентной маркировкой, которая является относительно простой и в обычном использовании на всех объектах пептидного синтеза. Использование in vivo изображений быстро производит данные биораспределения в контексте живой системы, в то время как раздел обеспечивает большую углубленную информацию о поглощении пептида и локализации в клетках путем сохранения морфологических деталей. Этот протокол может быть применен к широкому кругу органов и тканей, таких как сердце, легкие, печень, почки, мозг, селезенка, желудок, толстый кишечник, тонкий кишечник, скелетная мышца, кости, яички / яичники, и глаза.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модели животных имеют важное значение для разработки доклинических лекарственных средств на каждом этапе процесса от идентификации новых КП, исследований биораспределения, механизма трансдукции, до в конечном счете тестирования на эффективность доставленного груза с использованием этих новых КПП в качестве векторов. Есть много широко используемых методов для оценки биораспределения, таких как гистология, ядерная медицина изображений (SPECT и ПЭТ), и in vivo оптической визуализации12. Методы ядерной визуализации могут быть обременительными из-за ограниченности малых животных SPECT и ПЭТ-систем, а также способность производить радиолейбл-наркотики конъюгаты, которые требуют опыта радиохимика. В отличие от флуоресцентных этикеток гораздо проще и может быть экономически эффективным для работы. Протокол, описанный в настоящем документе, позволяет быстро анализировать биораспределение с помощью нескольких методов. Ex vivo весь орган флуоресцентной оптической визуализации позволяет немедленное сравнение флуоресценции между различными тканями и группами лечения и может определить поглощение органов и время, чтобы пик поглощения в органе, представляющих интерес в полуквантитивной манере. Количественная гистология тканей требует более обширной обработки для лечения, сечения, изображения и анализа тканей, но она предоставляет больше данных на микроскопическом уровне и является современным стандартным методом. Стоит отметить, что прямое, количественное сравнение между двумя методами не представляется возможным, потому что аутофлюоресценция рассматривается с каждым методом для различных органов и возбуждения длин волны значительно варьируется.
Важной частью этого протокола является выбор правильного фторфора для обозначения кандидатов CPPs для экспериментов. Одной из потенциальных проблем является перекрытие спектров, что может быть проблематичным при необходимости нескольких фторфоров. Флуоресцентные носители DAPI и Cy5.5 не имеют перекрывающихся спектров. Однако для некоторых приложений, где требуется несколько фторфоров, риск спектрального перекрытия должен быть тщательно рассмотрен. В зависимости от используемой системы, выбор фторфора может быть ограничен. Поэтому знание возможностей системы является ключевым фактором. Флуоресцентные оптические системы лучше всего использовать с дальнеиными или ближними инфракрасными фторфорами из-за высокой абсорбции тканей коротких длин волн13. Фторфоры в диапазоне расширенного зеленого флуоресцентного белка имеют серьезные ограничения, потому что есть значительные аутофлюоресценции органов видели на его возбуждение длины волны, в частности, в мозге и ткани печени. В зависимости от условий эксперимента, некоторые фторфоры лучше избегать. Некоторые водорастворимые органические фторфоры имеют сильное взаимодействие с липидными билайнами, что может вызвать ложные срабатывания. Следовательно, принимая меры, чтобы определить, если фторфор имеет сильное сродство к ткани интерес рекомендуется14. Еще одним фактором, чтобы рассмотреть это выбор соответствующего метода спряжения фторфора, который может быть важным параметром, влияющим на результаты. CPPs можно маркировать флуоресцентно на N- или C-терминусе через ковалентную связь между N-терминус пептида и группой carboxyl красителя such as Cy5.5-NHS. Следует проявлять осторожность, поскольку механизм трансдукции большинства КПД не понимается в деталях и спряжение на одном конце может повлиять на механизм поглощения в большей степени, чем на другом конце. Другая возможность для маркировки CPPs через биотинилирование N-термин для спряжения флуоресцентно помечены streptavidin. Использование этой стратегии имеет удобство позволяет различные флуоресцентные стрептавидин конъюгаты, которые будут использоваться. Однако возможным ограничением этой стратегии является то, что биотин-стрептавидин комплекс представляет собой крупную конструкцию, которая потенциально может помешать трансдукции.
Флуоресцентные оптические системы визуализации являются эффективной стратегией для генерации сравнения флуоресценции между различными органами и лечения эффективно, но не в состоянии производить количественный показатель абсолютных концентраций в тканях. Это связано с легкими эффектами рассеяния в ткани, которое еще больше усугубляется естественным разнообразием размеров тканей и плотности, а также различиями в сосудистости, с переменным рассеянием флуоресценции. Ткань аутофлюоресценция может быть фактором, а также, из-за естественных биохимических источников, таких как коллаген, или диетические источники, как хлорофилл в пище13.
Гистология является наиболее часто используемым методом измерения биораспределения и потенциально может быть использован для точного измерения и сравнения поглощения через различные ткани с течением времени. Свет рассеяния проблемы избежать с помощью этого метода, потому что все ткани разделены на одну толщину15. Основным преимуществом этого метода является возможность включения дополнительных флуоресцентных этикеток postectioning для иммуногистохимии. Хотя добавление другого фторфора может сделать визуализацию более сложной, использование флуоресцентных этикеток может быть полезным для локализации CPP для определенных внутриклеточных отсеков, таких как лизосомы или митохондрии. Антитела могут быть использованы в конфокальной микроскопии эксперимент, чтобы определить, если транс-кандидат CPP колокализирует со структурой интересов, которые могут показать потенциал CPP в качестве агента доставки. Одним из ограничений этого метода является то, что подготовка слайдов из образцов органов может занять много времени, трудоемким, и склонны к человеческой ошибке12,15. При слайдах изображений следует проявлять осторожность, чтобы не изображение одного и того же места слишком долго, чтобы избежать фотосъемки. Некоторые фотосъемки будут неизбежны, в зависимости от чувствительности фторфора. Следует проявлять осторожность на каждом шагу этого протокола, чтобы защитить образцы от окружающего света и хранить их должным образом16. Мы рекомендуем, чтобы слайды хранились при 4 градусах Цельсия, защищенном светом, для будущих изображений.
Существуют различные методы для измерения биораспределения кандидата CPP, которые требуют специализированного оборудования и могут производить сопоставимые результаты, хотя они могут потребовать более сложной маркировки CPP. Протокол, описанный в настоящем документе, использует два совместимых метода для эффективного производства данных биораспределения в контексте живой системы, позволяя при этом получить более подробную информацию о пептидной интернализации в клетках из одного образца, тем самым сокращая число животных, необходимых для исследования, вдвое. Эти методы были использованы для генерации вышеуказанных данных, которые свидетельствуют о том, что оба метода могут быть использованы последовательно в одном и том же животном, и качество данных, генерируемых каждым из них. Наши результаты также подчеркивают неспособность напрямую соотнести результаты между этими двумя методами в количественном порядке.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
М.З. и K.S.F. поддерживаются Американской ассоциацией кардиологов в области научного развития 17SDG33411180, а также грантом, присуждаемым в рамках Pitt Innovation Challenge (PInCh®), через Клинический и Переводческий Институт Науки в Университете Питтсбурга.
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
| 12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
| 1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
| 20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
| 26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
| 28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
| 3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
| CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
| Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
| Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
| Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
| Ethanol | |||
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
| Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
| Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
| Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
| Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
| Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
| Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
| Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
| Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
| Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
| Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |
References
- Green, M., Loewenstein, P. M. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell. 55 (6), 1179-1188 (1988).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55 (6), 1189-1193 (1988).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Cell-type specific penetrating peptides: therapeutic promises and challenges. Molecules. 20 (7), 13055-13070 (2015).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Identification and characterization of tissue-specific protein transduction domains using peptide phage display. Methods in Molecular Biology. 683, 277-289 (2011).
- Zahid, M., et al. Identification of a cardiac specific protein transduction domain by in vivo biopanning using a M13 phage peptide display library in mice. PLoS One. 5 (8), e12252 (2010).
- Zahid, M., et al. Cardiac Targeting Peptide, a Novel Cardiac Vector: Studies in Bio-Distribution, Imaging Application, and Mechanism of Transduction. Biomolecules. 8 (4), E147 (2018).
- Amblard, M., Fehrentz, J. A., Martinez, J., Subra, G. Methods and protocols of modern solid phase Peptide synthesis. Molecular Biotechnology. 33 (3), 239-254 (2006).
- Katritzky, A. R., Yoshioka, M., Narindoshvili, T., Chung, A., Johnson, J. V. Fluorescent labeling of peptides on solid phase. Organic and Biomolecular Chemistry. 6 (24), 4582-4586 (2008).
- Prabhala, B. K., Mirza, O., Hojrup, P., Hansen, P. R. Characterization of Synthetic Peptides by Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1348, 77-82 (2015).
- Arms, L., et al. Advantages and Limitations of Current Techniques for Analyzing the Biodistribution of Nanoparticles. Frontiers in Pharmacology. 9, 802 (2018).
- Leblond, F., Davis, S. C., Valdes, P. A., Pogue, B. W. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. Journal of Photochemistry and Photobiology. 98 (1), 77-94 (2010).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose your label wisely: water-soluble fluorophores often interact with lipid bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
- McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
