In Vivo Imagem de Eficiências de Transdução de Peptídeo de Direcionamento Cardíaco
Summary
Descrevemos protocolos para avaliar o grau de transdução por peptídeos penetrantes por células utilizando sistemas de imagem ex vivo seguidos de incorporação de parafina, secção e microscopia fluorescente confocal usando peptídeos cardíacos como exemplo. Em nosso protocolo, um único animal pode ser usado para adquirir ambos os tipos de avaliação de imagem dos mesmos órgãos, reduzindo o número de animais necessários para estudos pela metade.
Abstract
Desde a descrição inicial dos domínios de transdução de proteínas, também conhecidos como peptídeos penetrantes celulares, há mais de 25 anos, tem havido intenso interesse no desenvolvimento desses peptídeos, especialmente os específicos de células, como novos vetores para a entrega de materiais diagnósticos e terapêuticos. Nosso trabalho anterior envolvendo exibição de phage identificou um novo, nonnaturally ocorrido, 12 peptídeos de aminoácidos de comprimento que chamamos de peptídeo de alvo cardíaco (CTP) devido à sua capacidade de transdufar tecido cardíaco normal in vivo com captação máxima vista em apenas 15 minutos após uma injeção intravenosa. Realizamos estudos detalhados de biodistribução injetando CTP rotulado com cianeina fluorofora5.5, permitindo que ele circule por vários períodos de tempo, e eutanásia, fixação e secção de múltiplos órgãos seguidos de imagens de microscopia fluorescente. Nesta publicação, descrevemos esses processos, bem como ex vivo de imagens de órgãos colhidos utilizando um sistema de imagem in vivo em detalhes. Fornecemos metodologias e práticas detalhadas para a realização de estudos de transdução, bem como estudos de biodistribução utilizando o CTP como exemplo.
Introduction
A membrana plasmática celular é uma barreira semipermeável que é essencial para a integridade e sobrevivência celular e serve para regular o interior da célula controlando o movimento das substâncias para dentro da célula. Embora vital para a sobrevivência, também apresenta uma barreira para a entrega de carga para a célula. Em 1988, o trans-ativador da proteína de transcrição (Tat) do vírus da imunodeficiência humana foi mostrado para entrar em células cultivadas e promover a expressão genética viral1,,2, com os domínios responsáveis por essa transdução limitada a uma região rica em arginina e liinoácidos da terceira hélice3 Estes foram assim chamados peptídeos penetrantes de células (CPPs). Isso foi seguido por pesquisas que mostram a capacidade do peptídeo Tat de transportar β-galactosidase funcional em múltiplos tipos de células4. Desde a descrição inicial, o número de peptídeos penetrantes por células aumentou dramaticamente. Esses domínios de transdução são peptídeos curtos naturais ou sintéticos, tipicamente de 6 a 20 aminoácidos de comprimento, que são capazes de transportar cargas funcionais através de membranas celulares. Essas cargas podem variar de outros pequenos peptídeos, proteínas de comprimento total, ácidos nucleicos, nanopartículas, partículas virais, moléculas fluorescentes e radioisótopos5. Os CPPs iniciais descritos não eram específicos de células, com Tat sendo tomada por vários tipos de células e até mesmo cruzando a barreira hemencefálica4, limitando assim seu potencial terapêutico. Para identificar CPPs específicos para células, os investigadores realizaram uma exibição de phage utilizando grandes bibliotecas de phage disponíveis comercialmente6. Nosso próprio trabalho utilizando uma metodologia combinatória de exibição in vitro e in vivo phage levou à identificação de um CPP chamado peptídeo de alvo cardíaco (CTP)7, um peptídeo de 12 aminoácidos, que ocorre nonnaturalmente (NH2-APWHLSSQYSRT-COOH) que tem como alvo o coração com pico de captação de 15 minutos após uma injeção intravenosa periférica8. Utilizando a colocalização imunofluorescente com actina, um marcador intracelular, e exclusão de laminina, um marcador de membrana celular, mostramos que a CTP é internalizada em cardiomiócitos de camundongos após uma injeção intravenosa7. Além disso, incubamos cardiomiócitos pluripotentes induzidos por células-tronco induzidos por humanos com CTP de dupla rotulação, rotulado com 6-carboxyfluoresceína em seu C-terminus e rhodamina em seu n-terminus através de uma ligação ester que só poderia ser cortada por esterases intracelulares. O rápido acúmulo de rhodamina em cardiomiócitos de espancamento foi observado dentro de 15 minutos na microscopia confocal8.
Neste artigo, apresentamos duas metodologias complementares que podem ser utilizadas para rastrear a biodistribução e confirmar a internalização específica do tecido das CPPs usando CTP como exemplo. Para essas metodologias, a CTP foi sintetizada, fluorescentemente rotulada no N-terminus com cianeto5.5 (CY5.5), e com amida-tampada no C-terminus para maior estabilidade do peptídeo. As duas metodologias utilizadas são sistemas de imagem óptica fluorescente in vivo e microscopia fluorescente de seções teciduais. Ambos os métodos são muito úteis no estudo da biodistribução, absorção e eliminação de CPPs fluorescentes rotulados. A vantagem de avaliar a biodistribução usando esses métodos em relação a outros, como tomografia de emissão de fótons único (SPECT) ou tomografia de emissão de pósitrons (PET), é que não há necessidade de rotulagem de radiolacção intensiva de CPPs em comparação com a rotulagem fluorescente, que é relativamente fácil e em uso rotineiro em todas as instalações de síntese de peptídeos. O uso de imagens in vivo produz rapidamente dados de biodistribução no contexto de um sistema vivo, enquanto a secção fornece maior informação aprofundada sobre a absorção de peptídeos e a localização dentro das células através da preservação de detalhes morfológicos. Este protocolo pode ser aplicado a uma grande variedade de órgãos e tecidos como coração, pulmão, fígado, rim, cérebro, baço, estômago, intestino grosso, intestino delgado, músculo esquelético, osso, testículos/ovários e olhos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelos animais são essenciais para o desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos em todas as etapas do processo, desde a identificação de novos CPPs, estudos de biodistribução, mecanismo de transdução, até, em última instância, testes para a eficácia da carga entregue usando esses novos CPPs como vetores. Existem muitos métodos comumente usados disponíveis para avaliar a biodistribução, como histologia, imagem de medicina nuclear (SPECT e PET), e imagem óptica in vivo12. Os métodos de imagem nuclear podem ser complicados devido à disponibilidade limitada de pequenos sistemas SPECT e PET animais, bem como a capacidade de produzir conjugados radiolabel-droga, que requerem a experiência de um radioquímico. Em contraste, os rótulos fluorescentes são muito mais simples e podem ser econômicos para trabalhar. O protocolo descrito neste artigo permite uma análise rápida da biodistribução utilizando múltiplos métodos. A imagem óptica fluorescente de órgãos ex vivo permite a comparação imediata da fluorescência em diferentes tecidos e grupos de tratamento e pode identificar a captação de órgãos e o tempo para o pico de captação de órgãos de interesse de forma semiquantitativa. A histologia quantitativa do tecido requer processamento mais extenso para tratar, seção, imagem e analisar tecidos, mas fornece mais dados sobre o nível microscópico e é uma técnica padrão atual. Vale ressaltar que a comparação direta e quantitativa entre as duas técnicas não é possível, pois a autofluorescência observada com cada técnica para diferentes órgãos e comprimentos de onda de excitação varia significativamente.
Uma parte importante deste protocolo é selecionar o fluoróforo certo para rotular CPPs candidatos para experimentos. Um problema em potencial é a sobreposição de espectros, o que pode ser problemático quando são necessários fluoroforos múltiplos. A mídia de montagem fluorescente DAPI e cy5.5 não têm espectros sobrepostos. No entanto, para certas aplicações onde são necessários fluoroforos múltiplos, o risco de sobreposição espectral precisa ser cuidadosamente considerado. Dependendo do sistema que está sendo utilizado, a seleção fluorófora pode ser limitada. Portanto, o conhecimento das capacidades do sistema é fundamental. Sistemas ópticos fluorescentes são melhor utilizados com fluoroforos vermelhos ou quase infravermelhos devido à alta absorção tecidual de comprimentos de onda mais curtos13. Fluoroforos na gama de proteína fluorescente verde aumentada têm uma grande limitação, porque há autofluorescência significativa de órgãos vistas em seu comprimento de onda de excitação, especificamente no cérebro e tecido hepático. Dependendo das condições de um experimento, alguns fluoroforos são melhor evitados. Alguns fluoroforos orgânicos solúveis em água têm uma forte interação com bicamadas lipídicas, o que pode causar falsos positivos. Assim, tomar medidas para determinar se um fluoróforo tem forte afinidade com o tecido de interesse é aconselhável14. Outro fator a considerar é selecionar o método apropriado de conjugação fluorófora, que pode ser um parâmetro importante que afeta os resultados. Os CPPs podem ser rotulados fluorescentemente no n- ou C-terminus através de uma ligação covalente entre o N-terminus do peptídeo e o grupo carboxyl do corante como Cy5.5-NHS. Deve-se tomar cuidado, pois o mecanismo de transdução da maioria das CPPs não é compreendido em detalhes e a conjugação em uma extremidade pode afetar mais o mecanismo de absorção do que na outra extremidade. Outra possibilidade de rotular CPPs é através da biotininging do N-terminus para conjugação para streptavidina fluorescentemente rotulado. O uso dessa estratégia tem a conveniência de permitir que diferentes conjugados fluorescentes de streptavidina sejam utilizados. No entanto, uma possível limitação dessa estratégia é que um complexo biotina-streptavidina é uma grande construção, que poderia potencialmente interferir na transdução.
Sistemas de imagem óptica fluorescente são uma estratégia eficaz para gerar comparação da fluorescência entre diferentes órgãos e tratamentos de forma eficiente, mas são incapazes de produzir uma medida quantitativa de concentrações absolutas no tecido. Isso se deve aos efeitos de dispersão da luz dentro do tecido, que é ainda mais agravado pela variedade natural em tamanhos e densidades teciduais, e diferenças na vascularização, com dispersão variável de fluorescência. A autofluorescência tecidual também pode ser um fator, devido a fontes bioquímicas de ocorrência natural, como colágeno, ou fontes dietéticas como clorofila nos alimentos13.
A histologia é o método mais usado para medir a biodistribução e pode potencialmente ser usado para medir e comparar com precisão a absorção entre diferentes tecidos ao longo do tempo. Problemas de dispersão de luz são evitados usando este método porque todos os tecidos são seccionados para a mesma espessura15. Uma grande vantagem deste método é a capacidade de incluir rótulos fluorescentes adicionais para a imunohistoquímica. Embora a adição de outro fluoróforo possa tornar a imagem mais desafiadora, o uso de rótulos fluorescentes pode ser útil para a localização de um CPP para compartimentos intracelulares particulares, como lysosomes ou mitocôndrias. Um anticorpo poderia ser usado em um experimento de microscopia confocal para determinar se um CPP candidato transduzido coloca com uma estrutura de interesse, o que pode mostrar o potencial de um CPP como agente de entrega. Uma limitação deste método é que a preparação de slides a partir de amostras de órgãos pode ser demorada, trabalhosa intensiva e propensa a erro humano12,15. Ao deslizar de imagem, deve-se tomar cuidado para não imaginar o mesmo local por muito tempo para evitar fotobleaching. Algumas fotos serão inevitáveis, dependendo da sensibilidade do fluoróforo. Deve-se tomar cuidado em cada etapa deste protocolo para proteger as amostras da luz ambiente e armazená-las adequadamente16. Recomendamos que os slides sejam armazenados a 4 °C, protegidos por luz, para imagens futuras.
Existem uma variedade de métodos disponíveis para medir a biodistribução de um CPP candidato que requerem equipamentos especializados e podem produzir resultados comparáveis, embora possam exigir rotulagem CPP mais complexa. O protocolo descrito neste artigo utiliza dois métodos compatíveis para produzir dados de biodistribução eficientemente no contexto de um sistema vivo, permitindo a aquisição de informações mais aprofundadas sobre a internalização do peptídeo dentro das células da mesma amostra, reduzindo pela metade o número de animais necessários para um estudo. Esses métodos foram utilizados para gerar os dados acima, que demonstram que ambos os métodos podem ser utilizados sequencialmente no mesmo animal, e a qualidade dos dados gerados por cada um. Nossos resultados também destacam a incapacidade de correlacionar diretamente os resultados entre as duas técnicas de forma quantitativa.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.Z. e K.S.F. são apoiados pelo American Heart Association Scientist Development Award 17SDG3341180, e por uma bolsa concedida sob o Pitt Innovation Challenge (PInCh®), através do Instituto de Ciência Clínica e Translacional da Universidade de Pittsburgh.
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
| 12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
| 1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
| 20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
| 26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
| 28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
| 3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
| CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
| Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
| Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
| Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
| Ethanol | |||
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
| Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
| Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
| Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
| Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
| Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
| Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
| Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
| Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
| Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
| Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |
References
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