心臓標的ペプチドの導入効率のインビボイメージング

ピッツバーグ大学の制度的動物管理および使用委員会は、これらの動物実験のいずれかを行う前に、この出版物に指定されたすべての動物プロトコルを承認しました。 注:このプロトコルは、パラフィンに臓器を埋め込み、切除し、蛍光顕微鏡を行うことによって、エキビボ光蛍光イメージングを利用したex vivo生体分布研究を行う方法を詳述しています。CTPは一例として用いられているが、この方法は蛍光標識CPPに適用することができる。 1. インビボイメージング 固相合成技術99,10を用いて、安定性を高めるためCy5.5およびC末方アミドで標識されたN末語を有するL-アミノ酸を用いたペプチド合成施設からCTPを合成する。注: 合成された全ての CpP は、11を使用する前に高速液体クロマトグラフィー (HPLC) および/またはマトリックスアシストレーザ脱離/イオン化 (MALDI) を使用して特徴付ける必要があります。 ジメチルスルホキシド(DMSO)で1mMまたは10mMストックのCTPを、アリコート、-80°C、光保護で保存します。注:ペプチドは凍結乾燥粉末として送達されます。凍結乾燥粉末は、-20°C、光保護、および吸湿条件下で長期(6ヶ月〜2年)保存することができます。DMSOで引用して保存する場合、フリーズ解凍サイクルは避けるべきです。 ケタミン/キシラジン溶液の組織重量2μL/g(100mg/kgケタミンおよび20mg/kgキシラジン)を筋肉内(後ろ脚)または腹腔内投与(左下四肢)で6週齢のCD1雌マウスの体重を量り、麻酔する。注: ケタミン/キシラジン溶液は、使用の日に新鮮にする必要があります..未使用のケタミン/キシラジンは、ケタミンが制御物質であるため、ログに記録されたボリュームと対に対して適切に処分する必要があります。十分なレベルの麻酔は、つま先ピンチへの応答の欠如によって評価されるように、5-7分で達成されます。 Cy5.5-CTPの10mg/kg用量を計算し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で200μL以下に希釈し、インスリン注射器を使用してレトロ軌道または尾静脈注射を通して注入する(図1A)。 ペプチドを15分から6時間の範囲で、事前に指定された時間循環させる。 施設動物の世話と使用委員会で指定された高CO2吸入方法を使用してマウスを安楽死させ、はさみを使用して胸腔を開く(図1B)。 右心房の側面に小さなニックを配置し、マウスの器官を固定し、赤血球を洗い流す二重目的のために26G針を使用して10%緩衝ホルマリンリンの3mLを注入するために使用する(図1C)。 心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、大腸、小腸、膀胱、卵巣/精巣、および脳を切除し、12ウェルプレートの個々のウェルに入れ、ex vivo光学画像撮影を行う(図1D)。 イメージ取得ソフトウェアを起動し、[初期化]ボタンをクリックして、システムのイメージングサンプルを準備します。イメージングウィザードを開き、蛍光を選択してからフィルタペアを選択し、染料リストからCy5.5染料を選択して、580 nm励起フィルタと620 nm発光フィルタを適用します。露出パラメータの手動設定を選択してから、ステージ位置をBに設定し、露出時間を1秒に設定し、F/ストップを8に設定し、ビンを小さく設定します。注: 励起エミッション フィルタは、使用するラベルによって異なります。使用されるラベルの励起および放出は、ソフトウェアに手動で入力して、励起フィルタと放出フィルタを割り当てることができます。飽和を避けるために、カウントが 600 から 60,000 の間であることを確認します。使用しているシステムによっては、自動取得の最適化が可能な場合があります。システムが、取得した画像を異なる設定で比較する補正を持っている場合は、自動設定を使用することができます。報酬がない場合、設定を決定し、保存し、サンプル間で一貫して使用する必要があります。 システムが完全に初期化されたら、目的の器官を12ウェルプレートに配置し、それを光学イメージングチャンバーの内部に配置し、サンプルが画像に必要に応じて配置されていることを確認します。[取得]を選択し、画像の保存場所を選択します。マウスに関する情報は、画像ラベルの編集ポップアップウィンドウに書き込むことができます。 イメージング後、チャンバーからサンプルを取り出し、室温での光保護(RT)を有するシンチレーションバイアル中の組織の体積の少なくとも20倍の体積に10%緩衝されたホルマリンリン酸を貯蔵する。 単位をラディアント効率に設定し、4×3 ROI を選択し、各ウェルを ROI の 1 つの正方形に均等に収まるように調整し、続いてクリックメジャーをクリックして、画像を定量化します。グリッド ROI 測定タブを開き、エクスポートを選択して、測定値を .cvs ファイルとして保存します。 2. ヒストロジー 注: 異なる臓器を得るためにステップ1.1-1.8に従ってください。あるいは、画像化された同じ器官をすぐにホルマリンに入れ、以下に詳述する断面化に使用することができる。 各臓器を10%緩衝されたホルマリンリンに10%ずつ保管してから、組織学用に処理する前に最低48時間保管します。 臓器が48時間後に十分に固定されている場合、臓器を組織処理に移し、カセットを埋め込み、組織処理機に入れる(図1E)。 処理機を70%エタノールで30分間脱水し、その後に80%エタノールを30分間、エタノールを30分間95%、エタノール95%で30分間、100%エタノールで15分間、100%エタノールを20分間、最後に100%エタノールを20分間設定します。 キシレン2xで組織をクリアし、各キシレン処理に30分ずつします。 クリアした組織を、各処理で30分間60°Cで4倍のパラフィンワックス4倍に浸潤する。 金属モールドを使用したパラフィンの埋め込み。溶融パラフィン(65°Cに保つ)で金型を充填し、冷たいプレートに移します。金型の底部のパラフィンが固まり始めると、臓器をパラフィンに入れる(図1F)。 標識されたカセットをモールドの上にバッキングとして置き、溶融パラフィンをオーバーフィルします。固体になるまで冷却します。次いで、ブロックを-20°Cの冷凍庫に一晩保管し、ワックスをさらに収縮させて金型から容易に取り外します。注:ブロックは、ライト保護付きのRTで保存できるようになりました。 蒸留水で38°Cの水浴を準備します。6°の刃の角度および10 μmのセクションの厚さとのミクロトームを設定します。 ミクロトームに組織ブロックを取り付け、組織を含む切片が得られるまで切断を開始します。その後、ブロックを水の中に5分間下に置くか、組織が水分を吸収するまで(例えば、組織の薄い白い輪郭がブロック[図1G]に現れる場合)注: ブレードは、セクションの品質を確保するために頻繁に交換する必要があります。 組織を平らな氷のブロックに10分間置き、ステップ2.9と同じ方向にミクロトームに戻します。セクションを取り始め、切り捨てられたセクションがそれぞれ6-10セクションの長いリボンを形成できるようにします。滑り台を覆うのに十分な長さの良質リボンが作られるまで、最適以下のパラフィンリボンを捨てます。切断速度、組織保湿、水浴温度を調整して、組織切片のせん断やしわを避け、切削加工を最適化します。注:組織が抜け落ちた穴、組織の裂け目、または組織のきついしわや折り目がある部分は廃棄する必要があります。 慎重に鈍いエッジ鉗子と選択の品質のリボンを選び、38 °C水浴の表面に浮かぶ。セクションが滑らかになるまで表面に座らせ、パラフィンが崩壊してセクションを引き裂くのを防ぐために長く放置しないように注意してください。 平らな部分をきれいなガラススライドの表面に浮かべる。スライドを65°Cのオーブンに30分間入れ、ワックスを溶かします。注: これらのスライドは、光保護機能付きの RT に保存できます。 各処理に対して、キシレン3x、10分でスライドをデパラフィン化します。 組織を5分間100%エタノールで再水和し、続いて5分間95%エタノール、5分間エタノール70%、5分間50%エタノール、そして最後に5分間のトリス緩衝生理食塩水(TBS)を1xにして(図1H)。スライドを一晩乾燥させます。注: これらのスライドは、ライトプロテクトである限り、RT で長期間保存できます。 4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)を含む実装媒体の125 μLを使用してカバースリップでスライドを取り付けます, 核蛍光プローブ (図 1I).ドライスライドはRTで一晩、光保護されています。注:乾燥スライドは、光保護、4°Cで長期保存することができます。 蛍光顕微鏡を用いた画像スライド。注: 飽和画像は定量的に有用ではないため、避けてください。露出とゲインの設定を調整すると、飽和を避けることができます。比較するサンプル間で同じ設定を使用するように注意してください。露出時間を制限することによって組織の漂白を避ける.