In Vivo Beeldvorming van transduction efficiëntie van cardiale targeting Peptide
Summary
We beschrijven protocollen voor het beoordelen van de mate van transductie door cel-penetrerende peptiden met behulp van ex vivo imaging systemen, gevolgd door paraffine inbedding, sectie, en confocale fluorescerende microscopie met behulp van cardiale targeting peptide als voorbeeld. In ons protocol kan één dier worden gebruikt om beide soorten beeldvormingsbeoordeling van dezelfde organen te verkrijgen, waardoor het aantal dieren dat nodig is voor studies met de helft wordt gehalveerd.
Abstract
Sinds de eerste beschrijving van eiwittransductiedomeinen, ook bekend als celindringende peptiden, meer dan 25 jaar geleden, is er grote belangstelling geweest voor de ontwikkeling van deze peptiden, met name celspecifieke, als nieuwe vectoren voor het leveren van diagnostische en therapeutische materialen. Ons verleden werk met faag display geïdentificeerd een nieuwe, niet-natuurlijke voorkomende, 12 aminozuur-lange peptide dat we noemde cardiale targeting peptide (CTP) vanwege zijn vermogen om normaal hartweefsel transduceren in vivo met piekopname gezien in zo weinig als 15 min na een intraveneuze injectie. We hebben gedetailleerde biodistributiestudies uitgevoerd door CTP te injecteren met fluorofofine5.5, waardoor het gedurende verschillende perioden kan circuleren en meerdere organen euthanaseren, bevestigen en doorsneed, bevestigt en doorsneed, gevolgd door fluorescerende microscopiebeeldvorming. In deze publicatie beschrijven we deze processen en ex vivo beeldvorming van geoogste organen met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem in detail. Wij bieden gedetailleerde methodologieën en praktijken voor het uitvoeren van transductie en biodistributiestudies met CTP als voorbeeld.
Introduction
Het celplasmamembraan is een semipermeabele barrière die essentieel is voor celintegriteit en overleving en dient om het binnenste van de cel te reguleren door de beweging van stoffen in de cel te controleren. Hoewel het van vitaal belang is om te overleven, vormt het ook een barrière voor de levering van lading aan de cel. In 1988, de trans-activator van transcriptie (Tat) eiwit van de menselijke immunodeficiëntie virus werd aangetoond dat gekweekte cellen in te voeren en te bevorderen virale genexpressie1,2, met de domeinen die verantwoordelijk zijn voor deze transduction beperkt tot een arginine en lysine rijke 13-aminozuur regio van de derde helix3 Deze werden dus genoemd cel penetrating peptiden (CPPs). Dit werd gevolgd door onderzoek waaruit blijkt dat het vermogen van de Tat peptide om functionele β-galactosidase te dragen in meerdere celtypes4. Sinds de eerste beschrijving is het aantal cel-doordringende peptiden drastisch toegenomen. Deze transductiedomeinen zijn van nature voorkomende of synthetische korte peptiden, meestal 6−20 aminozuren lang, die in staat zijn om functionele ladingen over celmembranen te vervoeren. Deze ladingen kunnen variëren van andere kleine peptiden, full-length eiwitten, nucleïnezuren, nanodeeltjes, virale deeltjes, fluorescerende moleculen, en radio-isotopen5. De eerste beschreven CSP’s waren niet celsp specifiek, waarbij Tat werd opgenomen door meerdere celtypen en zelfs de bloed-hersenbarrière4kruist, waardoor het therapeutisch potentieel werd beperkt. Om celspecifieke CSP’s te identificeren, hebben onderzoekers faagweergave uitgevoerd met behulp van grote, commercieel beschikbare faagbibliotheken6. Ons eigen werk met behulp van een combinatorische in vitro en in vivo faagdisplay methodologie leidde tot de identificatie van een CPP genaamd cardiale targeting peptide (CTP)7, een 12-aminozuur, niet-natuurlijke voorkomende peptide (NH2-APWHLSSQYSRT-COOH) dat het hart richt met piekopname op 15 minuten na een intranaveneuze injectie8. Met behulp van immunofluorescente colocalisatie met actine, een intracellulaire marker, en uitsluiting van laminine, een celmembraan marker, toonden we aan dat CTP is geïnternaliseerd in muis cardiomyocyten na een intraveneuze injectie7. Bovendien hebben we geïncubeerd menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide kloppen cardiomyocyten met dual-label CTP, gelabeld met 6-carboxyfluorescein op zijn C-terminus en rhodamine op zijn N-terminus door middel van een ester koppeling die alleen kon worden losgelijmd door intracellulaire esterases. Snelle accumulatie van rhodamine in het verslaan van cardiomyocyten werd waargenomen binnen 15 min op confocale microscopie8.
In dit artikel presenteren we twee gratis methodologieën die kunnen worden gebruikt om biodistributie bij te houden en weefselspecifieke internalisering van CCP’s te bevestigen met CTP als voorbeeld. Voor deze methodologieën werd CTP gesynthetiseerd, fluorescerend gelabeld op het N-eindpunt met cyanine5.5 (CY5.5), en amide-afgetopt op de C-terminus voor een grotere peptide stabiliteit. De twee gebruikte methoden zijn in vivo fluorescerende optische beeldvormingssystemen en fluorescerende microscopie van weefselsecties. Beide methoden zijn zeer nuttig bij het bestuderen van biodistributie, opname en eliminatie van fluorescerend gelabelde CCP’s. Het voordeel van het beoordelen van biodistributie met behulp van deze methoden ten opzichte van andere, zoals single-photon emissie tomografie (SPECT) of positron emissie tomografie (PET), is dat er geen noodzaak voor de tijd-intensieve radio-etikettering van CSP’s in vergelijking met fluorescerende etikettering, dat is relatief eenvoudig en in routinegebruik op alle peptide synthese faciliteiten. Het gebruik van in vivo beeldvorming produceert snel biodistributiegegevens in de context van een levend systeem, terwijl sectioning meer diepgaande informatie biedt over peptide opname en lokalisatie binnen cellen via het behoud van morfologische details. Dit protocol kan worden toegepast op een breed scala van organen en weefsels, zoals het hart, long, lever, nier, hersenen, milt, maag, dikke darm, dunne darm, skeletspieren, bot, teelballen / eierstokken, en ogen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diermodellen zijn essentieel voor de ontwikkeling van preklinische geneesmiddelen in elke fase van het proces, van de identificatie van nieuwe CSP’s, biodistributiestudies, mechanisme van transductie, tot het uiteindelijk testen op de werkzaamheid van de geleverde lading met behulp van deze nieuwe CSP’s als vectoren. Er zijn veelgebruikte methoden beschikbaar om biodistributie te beoordelen, zoals histologie, nucleaire geneeskunde beeldvorming (SPECT en PET), en in vivo optische beeldvorming12. Nucleaire beeldvormingsmethoden kunnen omslachtig zijn vanwege de beperkte beschikbaarheid van kleine dierspect- en PET-systemen, evenals de mogelijkheid om radiolabel-drug conjugaten te produceren, waarvoor de expertise van een radiochemicus vereist is. Fluorescerende labels zijn daarentegen veel eenvoudiger en kunnen kosteneffectief zijn om mee te werken. Het protocol beschreven in dit document maakt een snelle analyse van de biodistributie met behulp van meerdere methoden. Ex vivo hele orgaan fluorescerende optische beeldvorming zorgt voor de onmiddellijke vergelijking van fluorescentie over verschillende weefsels en behandelingsgroepen en kan orgaanopname en tijd om de opname in orgaan van belang op een semikwaansmanier te identificeren. Kwantitatieve weefsel histologie vereist uitgebreidere verwerking voor de behandeling, sectie, beeld, en analyseren van weefsels, maar het biedt meer gegevens op microscopisch niveau en is een huidige standaard techniek. Het is de moeite waard op te merken dat directe, kwantitatieve vergelijking over de twee technieken niet mogelijk is, omdat de autofluorescentie gezien met elke techniek voor verschillende organen en excitatie golflengtes aanzienlijk varieert.
Een belangrijk onderdeel van dit protocol is het selecteren van de juiste fluorofolaat om kandidaat-CPS te labelen voor experimenten. Een potentieel probleem is spectra overlap, die problematisch kan zijn wanneer meerdere fluoroforen nodig zijn. De DAPI tl-montagemedia en Cy5.5 hebben geen overlappende spectra. Voor bepaalde toepassingen waar meerdere fluoroforen nodig zijn, moet echter zorgvuldig worden overwogen om het risico op spectrale overlap te nemen. Afhankelijk van het systeem dat wordt gebruikt, kan de fluorofoforselectie beperkt zijn. Daarom is kennis van de mogelijkheden van het systeem essentieel. Fluorescerende optische systemen worden het best gebruikt met ver-rode of nabij-infrarood fluoroforen als gevolg van de hoge weefselabsorptie van kortere golflengten13. Fluoroforen in het bereik van verbeterde groene fluorescerende eiwitten hebben een belangrijke beperking, omdat er significante orgaanautofluorescentie gezien op zijn excitatie golflengte, met name in de hersenen en leverweefsel. Afhankelijk van de omstandigheden van een experiment, kunnen sommige fluoroforen het best worden vermeden. Sommige in water oplosbare organische fluoroforen hebben een sterke interactie met lipide bilayers, die valse positieven kunnen veroorzaken. Daarom is het raadzaam om stappen te ondernemen om te bepalen of een fluorofof heeft sterke affiniteit met het weefsel van belang14. Een andere factor om te overwegen is het selecteren van de juiste methode van fluorofoof vervoeging, die een belangrijke parameter kan zijn die de resultaten beïnvloedt. CPS kunnen fluorescerend worden gelabeld op het N- of C-eindpunt door middel van een covalente binding tussen het N-eindpunt van het peptide en de carboxylgroep van de kleurstof zoals Cy5.5-NHS. Er moet voor worden gezorgd, omdat het mechanisme voor transductie van de meeste CCP’s niet in detail wordt begrepen en vervoeging aan de ene kant het opnamemechanisme meer dan aan de andere kant kan beïnvloeden. Een andere mogelijkheid voor het labelen van CCP’s is door het biotineyleren van het N-eindpunt voor vervoeging tot fluorescerend gelabeld streptavidin. Met behulp van deze strategie heeft het gemak van het toestaan van verschillende fluorescerende streptavidin conjugaten worden gebruikt. Een mogelijke beperking van deze strategie is echter dat een biotine-streptavidin-complex een grote constructie is, die mogelijk de transductie zou kunnen verstoren.
Fluorescerende optische beeldvormingssystemen zijn een effectieve strategie voor het efficiënt vergelijken van fluorescentie tussen verschillende organen en behandelingen, maar zijn niet in staat om een kwantitatieve maatstaf van absolute concentraties in weefsel te produceren. Dit is te wijten aan lichtverstrooiingseffecten in het weefsel, die verder worden verergerd door de natuurlijk voorkomende variëteit in weefselgroottes en -dichtheden, en verschillen in vasculariteit, met variabele fluorescentieverstrooiing. Weefsel autofluorescentie kan ook een factor zijn, als gevolg van natuurlijk voorkomende biochemische bronnen zoals collageen, of voedingsbronnen zoals chlorofyl in voedsel13.
Histologie is de meest gebruikte methode voor het meten van biodistributie en kan mogelijk worden gebruikt om de opname in verschillende weefsels in de loop van de tijd nauwkeurig te meten en te vergelijken. Lichtverstrooiingsproblemen worden vermeden met behulp van deze methode omdat alle weefsels zijn doorsneden tot dezelfde dikte15. Een groot voordeel van deze methode is de mogelijkheid om extra fluorescerende labels postssecties voor immunohistochemie op te nemen. Hoewel de toevoeging van een andere fluorofofoër beeldvorming uitdagender zou kunnen maken, kan het gebruik van fluorescerende etiketten nuttig zijn voor de lokalisatie van een CPP aan bepaalde intracellulaire compartimenten, zoals lysosomen of mitochondriën. Een antilichaam kan worden gebruikt in een confocale microscopie experiment om te bepalen of een getransduceerde kandidaat CPP colocalizes met een structuur van belang, die het potentieel van een CPP als een leveringsagent kan aantonen. Een beperking van deze methode is dat de voorbereiding van dia’s uit orgaanmonsters tijdrovend, arbeidsintensief en vatbaar voor menselijke fouten12,15kan zijn . Bij beeldvorming dia’s, zorg moet worden genomen om niet beeld dezelfde locatie te lang om te voorkomen dat fotobleaching. Sommige fotobleaching zal onvermijdelijk zijn, afhankelijk van de gevoeligheid van de fluorofof. Bij elke stap van dit protocol moet worden gezorgd voor zorg om de monsters te beschermen tegen omgevingslicht en ze goed op te slaan16. Wij raden aan dia’s op te slaan bij 4 °C, lichtbeschermd, voor toekomstige beeldvorming.
Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor het meten van de biodistributie van een kandidaat-CPP die gespecialiseerde apparatuur nodig heeft en vergelijkbare resultaten kan opleveren, hoewel ze complexere CPP-etikettering vereisen. Het in dit document beschreven protocol maakt gebruik van twee compatibele methoden om biodistributiegegevens efficiënt te produceren in de context van een levend systeem, terwijl het mogelijk wordt om meer diepgaande informatie over de internalisatie van peptide in cellen uit hetzelfde monster te verkrijgen, waardoor het aantal dieren dat nodig is voor een studie met de helft wordt gehalveerd. Deze methoden werden gebruikt om de bovenstaande gegevens te genereren, waaruit blijkt dat beide methoden achtereenvolgens kunnen worden gebruikt in hetzelfde dier, en de kwaliteit van de gegevens gegenereerd door elk. Onze resultaten benadrukken ook het onvermogen om de resultaten direct te correleren tussen de twee technieken op een kwantitatieve manier.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.Z. en K.S.F. worden ondersteund door American Heart Association Scientist Development Award 17SDG33411180, en door een subsidie toegekend in het kader van de Pitt Innovation Challenge (PInCh®), via het Clinical and Translational Science Institute aan de Universiteit van Pittsburgh.
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
| 12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
| 1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
| 20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
| 26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
| 28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
| 3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
| CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
| Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
| Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
| Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
| Ethanol | |||
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
| Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
| Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
| Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
| Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
| Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
| Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
| Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
| Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
| Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
| Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |
References
- Green, M., Loewenstein, P. M. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell. 55 (6), 1179-1188 (1988).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55 (6), 1189-1193 (1988).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Cell-type specific penetrating peptides: therapeutic promises and challenges. Molecules. 20 (7), 13055-13070 (2015).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Identification and characterization of tissue-specific protein transduction domains using peptide phage display. Methods in Molecular Biology. 683, 277-289 (2011).
- Zahid, M., et al. Identification of a cardiac specific protein transduction domain by in vivo biopanning using a M13 phage peptide display library in mice. PLoS One. 5 (8), e12252 (2010).
- Zahid, M., et al. Cardiac Targeting Peptide, a Novel Cardiac Vector: Studies in Bio-Distribution, Imaging Application, and Mechanism of Transduction. Biomolecules. 8 (4), E147 (2018).
- Amblard, M., Fehrentz, J. A., Martinez, J., Subra, G. Methods and protocols of modern solid phase Peptide synthesis. Molecular Biotechnology. 33 (3), 239-254 (2006).
- Katritzky, A. R., Yoshioka, M., Narindoshvili, T., Chung, A., Johnson, J. V. Fluorescent labeling of peptides on solid phase. Organic and Biomolecular Chemistry. 6 (24), 4582-4586 (2008).
- Prabhala, B. K., Mirza, O., Hojrup, P., Hansen, P. R. Characterization of Synthetic Peptides by Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1348, 77-82 (2015).
- Arms, L., et al. Advantages and Limitations of Current Techniques for Analyzing the Biodistribution of Nanoparticles. Frontiers in Pharmacology. 9, 802 (2018).
- Leblond, F., Davis, S. C., Valdes, P. A., Pogue, B. W. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. Journal of Photochemistry and Photobiology. 98 (1), 77-94 (2010).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose your label wisely: water-soluble fluorophores often interact with lipid bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
- McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
