نموذجان مختلفان لتفضيل المكان في الوقت الحقيقي باستخدام علم الوراثة البصرية داخل منطقة فينترال تيمنتال من الماوس
Summary
هنا نقدم اثنين من سهلة لمتابعة خطوة بخطوة بروتوكولات لنماذج تفضيل مكان باستخدام optogenetics في الفئران. باستخدام هذه الاجهزة المختلفة ، والأفضلية وتجنب السلوكيات يمكن تقييمها بقوة داخل نفس الجهاز مع الانتقائية المكانية والزمنية العالية ، وبطريقة مباشرة.
Abstract
فهم كيف يؤدي تنشيط الخلايا العصبية إلى إخراج سلوكي محدد أمر أساسي لعلم الأعصاب الحديث. الجمع بين علم البصريات في القوارض مع الاختبار السلوكي في نماذج التحقق من صحتها يسمح لقياس العواقب السلوكية على تحفيز الخلايا العصبية متميزة في الوقت الحقيقي مع الانتقائية المكانية والزمنية العالية، وبالتالي إنشاء العلاقات السببية بين تنشيط الخلايا العصبية والسلوك. هنا ، نصف بروتوكول خطوة بخطوة لنموذج تفضيل المكان في الوقت الحقيقي (RT-PP) ، وهو نسخة معدلة من اختبار تفضيل المكان المكيف الكلاسيكي (CPP). يتم تنفيذ RT-PP في جهاز من ثلاث مقصورات ويمكن استخدامها للإجابة إذا كان التحفيز الأوفيوراثي لتجمعات عصبية معينة مجزٍ أو مجزٍ. كما نصف أيضًا نسخة بديلة من بروتوكول RT-PP، وهو ما يسمى بروتوكول تفضيل المقصورة المحايدة (NCP) ، والذي يمكن استخدامه لتأكيد النفور. ويستند النهجان على امتدادات المنهجية الكلاسيكية الناشئة من علم الصيدلة السلوكية والتنفيذ الأخير لعلم البصريات في مجال علم الأعصاب. وبصرف النظر عن قياس تفضيل المكان في الوقت الحقيقي، يمكن لهذه الاجهزة أيضا إعطاء معلومات بشأن السلوك مكيفة. نحن نقدم بروتوكولات خطوة بخطوة سهلة المتابعة إلى جانب أمثلة من بياناتنا الخاصة ونناقش الجوانب الهامة التي يجب مراعاتها عند تطبيق هذه الأنواع من التجارب.
Introduction
أدى تنفيذ optogenetics ، وهي أداة تجريبية علم الأعصاب الحديثة التي يتم فيها استخدام الضوء للسيطرة على نشاط الخلايا العصبية ، في السنوات الأخيرة إلى تقدم كبير في فهم كيفية تأثير مجموعات معينة من الخلايا العصبية على السلوك1،2،3. الانتقائية المكانية والزمنية المعلقة من علم الوراثة البصرية يسمح بإقامة علاقات سببية بين الإثارة أو تثبيط مجموعات الخلايا ذات الاهتمام والإخراج السلوكي2،3. يتم ضمان الانتقائية المكانية في علم البصريات عادة من خلال نظام Cre-Lox الذي يؤدي فيه نشاط Rere recombinase إلى إعادة تركيب أي تسلسلات الحمض النووي الموجودة بين مواقع Lox ، ما يسمى أليل المتخبط (محاط بمواقع لوكس)4. الهدف من استخدام نظام كري لوكس في optogenetics هو تحقيق التعبير عن الأليسل ترميز optogeneticoptoins في الخلايا العصبية محددة من الفائدة في حين ترك الخلايا العصبية المحيطة خالية من التعبير. Opsins هي بروتينات حساسة للضوء التي على ضوء التحفيز من موجة محددة طول السماح تدفق أيون التي تؤثر على الإثارة العصبية أو تأثير الوظائف الخلوية عن طريق تحوير مسارات المؤثرات المصب. المتغيرات الجديدة من opsins التي تختلف في العمل (مثير، مثبطة، مغيرة)، آلية، تفعيل الطول الموجي الضوء وخصائص الحركية5 يجري تطويرها باستمرار لتلبية احتياجات النهج التجريبية المحددة. فيما يتعلق بالإثارة ، فإن استخدام أوبسين إزالة الاستقطاب أو الاستقطاب المفرط يملي نشاط الخلايا العصبية (الإثارة أو التثبيط ، على التوالي) على تحفيز الضوء عند طول موجي محدد يتم توصيله إلى الدماغ3.
النشاط المروج انتقائية توجه التعبير عن Recombinase الكري إلى الخلايا العصبية ذات الاهتمام. من خلال تنفيذ أليل تتخبط من opsin من الفائدة, سوف Cre بوساطة إعادة تركيب ضمان أن يتم التعبير عن Opsin بشكل انتقائي في الخلايا العصبية التي تشارك في التعبير عن إعادة الدمج الكري3,6. وقد ثبت هذا الاستخدام من المعدلة وراثيا مزدوجة لتوجيه الانتقائية المكانية فعالة جدا في علم البصريات. وهكذا، في حين يتم تسليم الضوء لتحفيز لتنشيط opsins على نطاق واسع من خلال الألياف البصرية المزروعة داخل المخ متصلة مصدر الضوء (LED أو الليزر)3،والخلايا العصبية فقط التعبير عن كل من الكري recombinase وأليل opsin floxed سوف تستجيب لهذا التحفيز. يمكن تحقيق نظام Cre-Lox في القوارض بطرق مختلفة باستخدام المعدلة وراثيا فقط (يتم ترميز كل من Rere recombinase وبناء opsin floxed في الحيوانات المعدلة وراثيا) ، والحقن الفيروسية فقط (يبني الحمض النووي لRecombinase وopsin floxed على حد سواء يتم تسليمها عن طريق الناقل الفيروسي) ، أو مزيج من الاثنين (على سبيل المثال ، يتم ترميز Rere recombinase بواسطة الحيوان المعدل ة وراثيا التي يتم حقنها مع فيروس يحمل بناء opsin floxed)5. عادة ما يتم استنساخ بناء الحمض النووي opsin floxed في الإطار مع جين مراسل لتمكين تصور إعادة التركيب بوساطة الكري في أقسام الأنسجة. في حين يمكن أيضا إجراء علم البصريات في الفئران، وقد تم إنشاء البروتوكولات المقدمة للفئران. للبساطة ، سيتم الإشارة إلى الفئران التي تحمل كل من Rere recombinase وopsin floxed باسم “الفئران علم الوراثة البصرية”. في البروتوكولات الموضحة أدناه ، تم إنشاء فئران علم البصريات من قبل معدل وراثيا مختلطة (Rere recombinase تحت سيطرة اثنين من المروجين مختلفة) والفيروسية (باستخدام فيروس المرتبطة بالأدينو ، AAV ، لتقديم بناء الحمض النووي opsin floxed — في حالتنا ChR2/H134R) النهج. إن الحصول على خطوط الماوس المعدلة وراثياً والحفاظ عليها هو جزء أساسي من المنهجية. يمكن إنتاج الفئران المعدلة وراثيا Cre-driver وfloxed opsin لكل غرض، أو شراؤها إذا كانت متاحة تجاريا، كما يمكن لمجموعة من الفيروسات التي تحمل تسلسل الحمض النووي ترميز الـ Rere recombinase وopsins floxed في أشكال مختلفة.
وقد ثبت Optogenetics إلى جانب الاختبار السلوكي ليكون أداة قيمة لدراسة دور مناطق الدماغ متميزة، أو مجموعات الخلايا العصبية منفصلة، في أنواع معينة من السلوك. في سياق السلوك المرتبط بالمكافأة ، مكّن علم البصريات من التحقق من النتائج السابقة في مجالات علم الأدوية السلوكي وعلم النفس التجريبي ، وسمح أيضًا بمستوى جديد من التشريح المرتبط بالتسلسل الزمني في كيفية تأثير بعض الخلايا العصبية على السلوك. إحدى الطرق التي تم استخدامها في العديد من الدراسات لتقييم السلوك المرتبط بالمكافأة هي نسخة معدلة من الطريقة الكلاسيكية المعروفة باسم تفضيل المكان المكيف (CPP). وقد استخدمت الكلاسيكية CPP لتقييم الخصائص المجزية أو aversive من المخدرات من تعاطي من خلال قدرتها على حث الجمعيات بافلوفيان مع العظة من البيئة7،8. في بافلوفيان ، يكون الدواء حافزًا غير مشروط لأنه يمكن أن يثير الاقتراب أو الانسحاب إذا كان مجزياً أو مُفاقًا ، على التوالي. الاقتران المستمر للدواء مع مختلف المحفزات المحايدة ، التي هي نفسها لا تثير أي استجابة ، يمكن أن يؤدي إلى الاقتراب أو الانسحاب بمجرد عرض المحايد سابقًا ، ولكن بعد الاقتران ، ما يسمى المحفزات المكيفة 9. عادة ما يتم إجراء تحليل CPP في جهاز يحتوي على جزأين من نفس الحجم ولكن حيث يتم تعريف كل مقصورة من خلال خصائص متميزة ، مثل نسيج الأرض وأنماط الجدار والإضاءة (المحفزات المحايدة). يتم توصيل المقصورات اثنين إما عن طريق ممر أو فتحة بين المقصورات. أثناء التكييف ، يتلقى هذا الموضوع ، عادة ما يكون قارضًا صغيرًا ، حقنًا سلبية من الدواء بينما يقتصر على إحدى الحجرتين الرئيسيتين والمالحة بينما يقتصر على المقصورة الأخرى. يتم تقييم الآثار المجزية للدواء في وقت لاحق في جلسة خالية من المخدرات عندما يسمح للموضوع لاستكشاف الجهاز بأكمله بحرية. ويعتبر مقدار الوقت الذي يقضيه في المقصورة سابقا المخدرات يقترن (استجابة مشروطة) لتعكس آليات التعلم بافلوفيان بوساطة بين الآثار المجزية للدواء والعظة من المقصورة المرتبطة إدارتها (المحفزاتمشروطة). إذا كان الحيوان يقضي المزيد من الوقت في المقصورة المقترنة بالمخدرات ، فقد تسبب الدواء في تفضيل مكان مشروط مما يعني أن له آثارًا مجزية على السلوك. من ناحية أخرى ، إذا كان يُنظر إلى الدواء على أنه أفيرسي ، فإن الحيوان سيتجنب المقصورة المقترنة بالمخدرات ويقضي المزيد من الوقت في المقصورة المقترنة بالمالحة ، مما يشير إلى نفور المكان المكيف (CPA)8،9،10،11.
منذ optogenetics يمكن تنفيذها للسيطرة على نشاط الخلايا العصبية في “الوقت الحقيقي” ، واستخدام نموذج سلوكي مماثل ، ولكن متميزة عن ، والإعداد CPP يسمح لقياس تفضيل المكان على التنشيط العصبي المباشر. ولذلك غالباً ما يشار إلى التحليل المستند إلى علم الوراثة البصرية لتفضيل المكان على أنه نموذج تحليل يُفضل في الوقت الحقيقي (RT-PP). في نموذج RT-PP ، يحل التحفيز البوجيني للخلايا العصبية المتميزة عبر نظام Cre-Lox محل التسليم النظامي لدواء يتم إجراؤه في CPP الكلاسيكي ، بحيث يقيس نموذج RT-PP بدلاً من ذلك إذا كان التحفيز العصبي المستحث بعلم الوراثة هو ينظر إليها على أنها مجزية أو أفيرسية. سيركز الوصف الحالي على فئران علم الوراثة البصرية ، ولكن أيضًا يمكن اختبار الفئران البصريات باستخدام بروتوكولات مماثلة.
بدلاً من التكييف إلى حجرة واحدة في وقت واحد كما هو الحال في نموذج CPP الكلاسيكي ، يُسمح للفأر ة علم الوراثة البصرية في نموذج RT-PP بالتحرك بحرية في الجهاز بأكمله ويتم تسجيل السلوك طوال الجلسة. يتم إقران الدخول إلى إحدى المقصورات مع التحفيز الضوئي داخل الجمجمة. تحت معلمات تحفيز الضوء المناسبة، سيتم تنشيط الخلايا العصبية التي تعبر عن opsin مثير بذلك. إذا كان ينظر إلى تحفيز الضوء على أنه مجزٍ ، فسيبقى الماوس optogenetics في المقصورة المقترنة بالضوء ، بينما إذا كان ينظر إلى تحفيز الضوء على أنه أفيرسيفي ، فإن الماوس سوف يخرج من المقصورة للهروب من التحفيز. يسمح هذا النوع من التحليل بتقييم التعلم الطارئ: يمكن أن يؤدي هذا الموضوع إلى تحفيز الضوء وبالتالي تنشيط الخلايا العصبية عن طريق إدخال حجرة ، ووقف التحفيز عن طريق الخروج من المقصورة ، على غرار الضغط على الرافعة أثناء مهمة مفيدة. وعلاوة على ذلك، يمكن تقييم آليات التعلم النقابي خلال الدورات اللاحقة حيث يقاس الوقت الذي يقضيه في كل مقصورة في غياب التحفيز. بهذه الطريقة ، يمكن للباحث أن ينفصل بين الآثار المجزية على الفور على تحفيز الخلايا العصبية ذات الأهمية وتكوين الذاكرة النقابية المتعلقة به12.
في الدراسة الحالية ، ونحن نصف اثنين خطوة بخطوة بروتوكولات الإعداد لoptogenetics يحركها سلوك تفضيل مكان الفئران تتحرك بحرية. يصف البروتوكول الأول RT-PP ضمن جهاز من ثلاث حجرات وتم تحديده استنادًا إلى البروتوكولاتالتي قدمها الجذر وزملاؤه13 والمؤلفون الآخرون12و14و15و16و17و18. تتكون التجربة من مرحلتين تتألفان من عدة جلسات يومية (كما هو موضح في الشكل 1A). تم تصميم كل جلسة لأغراض مختلفة ويتم تغيير معلمات التحفيز بالاقتران مع مقصورة وفقا لذلك. يتم استخدام الجلسة الأولى ،“Pretest” ، لتقييم الأفضلية الأولية للموضوع لأي من المقصورات. أثناء الاتصال بسلك التصحيح ، يُسمح لهذا الموضوع باستكشاف الجهاز بحرية في غياب التحفيز لمدة 15 دقيقة. إذا كان تفضيل الأولي ة إلى أي مقصورة واحدة هو أكثر من 80٪، يتم استبعاد الماوس من التحليل منذ التحيز الجانب الأولي قد يؤدي إلى انحراف التحليل. بعد“Pretest”،“المرحلة 1”يبدأ. الجزء الأول يتكون من جلستين متتاليتين، يوميا، 30 دقيقة من “RT-PP“. خلال “المرحلة 1“، يتم توصيل الماوس optogenetics إلى مصدر الليزر من خلال سلك التصحيح ووضعها في الساحة لاستكشاف بحرية. يتلقى الفأر تحفيز الليزر داخل الجمجمة عند الدخول إلى واحدة من المقصورات الرئيسية. ويمكن إجراء تجارب تجريبية لتحديد المقصورة التي سيتم تعيينها كمقصورة بالليزر وأيها غير مقترنة. إذا ثبت أن التحفيز مجزٍ ، سيتم اقتران الليزر بالمقصورة الأقل تفضيلًا خلال“Pretest”وإلى الأكثر تفضيلًا إذا كان التحفيز أفيرسي. وهكذا ، فإن البروتوكول RT -PP المقدم يتبع تصميمًا متحيزًا بمعنى أن تحفيز الليزر لا يتم تعيينه عشوائيًا إلى أي من المقصورات الرئيسية (تصميم غير متحيز) ، ولكن يتم اختياره لتجنب أي تفضيل أولي للفأرة. الدخول إلى المقصورة الرئيسية الأخرى أو المقصورة المحايدة التي تربط المقصورات الرئيسية اثنين لا يؤدي إلى تحفيز الضوء داخل الجمجمة وبالتالي ليست خفيفة مقترنة. تسمح هذه الجلسات بإجراء تقييم في الوقت الحقيقي للخصائص المجزية أو الوافر لتحفيز مجموعات عصبية محددة. في اليوم الأخير من “المرحلة 1“، جلسة 15 دقيقة دون أي تحفيز يحدث. تعمل هذه الجلسة على معالجة الاستجابات المكيفة (“CR“) التي تنتج عن التعلم النقابي بين التحفيز والبيئة التي تم تلقيها فيها. بعد ثلاثة أيام على الأقل من “المرحلة 1“،“مرحلة الانعكاس”يحدث الذي يتبع نفس الهيكل مثل “المرحلة 1” ولكن يتم الآن إقران المقصورة الرئيسية غير المقترنة سابقا مع التحفيز الضوئي. كما هو الحال في“المرحلة 1“، ويتبع جلستي التحفيز جلسة“CR”. يتم استخدام“مرحلة الانعكاس”لتأكيد أن سلوك الماوس يعتمد على التحفيز الأوبتوبجيني ولا يرتبط بالمعلمات العشوائية. يجب برمجة كل جلسة من جلسات تجربة RT-PP بشكل منفصل داخل برنامج التتبع. يصف البروتوكول الحالي مثل هذه الإعدادات داخل برنامج معين، ولكن يمكن استخدام أي برنامج تتبع آخر قادر على إرسال إشارات التشكيل الترانزستور-ترانزستور-منطق (TTL) إلى مصدر الضوء.
يصف البروتوكول الثاني إعداد ًا جديدًا يطلق عليه نموذج تفضيل المقصورة المحايدة (NCP). يستفيد هذا البروتوكول المعدل من RT-PP من صغر حجم وشفافية ممر الربط الذي يتم تجنبه بشكل طبيعي بواسطة الماوس بسبب تكوينه الضيق والشفاف. من خلال إقران كل من المقصورات الرئيسية مع تحفيز الضوء وترك الممر فقط خالية من تحفيز الضوء ، يمكن استخدام إعداد NCP لاختبار ما إذا كان التحفيز البوجيني سيجبر الماوس على قضاء المزيد من الوقت في الممر لتجنب تلقي التحفيز الأوجيني. من خلال مقارنة الوقت المستغرق في المقصورات المقترنة بالضوء مع الوقت الذي يقضيه في الممر ، يمكن التحقق من النفور الناجم عن البوجينيات. تتكون تجربة NCP من جلستين متتاليتين يوميتين حيث تتلقى فئران علم الوراثة البصرية التحفيز (30 دقيقة لكل منها) لقياس الأفضلية في الوقت الفعلي ، وجلسة واحدة خالية من الليزر (15 دقيقة) لتقييم الاستجابات المشروطة بشكل مماثل لتلك الموجودة في RT-PP البروتوكول.
تم التحقق من بروتوكولات RT-PP و NCP الواردة أدناه مؤخرًا في مختبرنا في دراسة كيفية مشاركة أنواع مختلفة من الخلايا العصبية الموجودة في منطقة tegmental البطنية (VTA) في جوانب مختلفة من السلوك المرتبط بالمكافأة12. هنا، لتجسيد تنفيذ بروتوكولات RT-PP و NCP، تم حقن ناقل الدوبامين (DAT)-Cre19 وناقل الغلوتامات المصنوعة على المركبات 2 (VGLUT2)-Cre20 الفئران المعدلة وراثياً بشكل مجسم مع AAV تحمل بناء الحمض النووي channelrhodopsin2 (ChR2) في VTA حيث تم زرع ألياف بصرية فوق VTA. الاستجابات السلوكية التي تم الحصول عليها عند تحليل هذه الفئران باستخدام RT-PP والبروتوكولات NCP المقدمة يبين كيف تفعيل الخلايا العصبية الدوبامين والغلوتاماتجية داخل VTA يؤدي إلى استجابات سلوكية مختلفة(الشكل 1).
يتم توفير بروتوكولات خطوة بخطوة لنماذج RT-PP و NCP بمعلومات تتراوح بين الجينوغرافيا للفئران المعدلة وراثياً والحقن الفيروسية الاستريوتاكسية ووضع الألياف البصرية، إلى برمجة برامج التتبع للتحكم بالليزر والسلوك تقييم. وبالإضافة إلى ذلك، تناقش اقتراحات إدخال تعديلات على البروتوكول من حيث بارامترات التحفيز والجوانب التجريبية التي يمكن أن تؤثر على النتيجة العلمية. في حين يتم وصف البروتوكولات في سياق VTA ، يمكن تطبيقها على أي منطقة الدماغ أو السكان العصبية ، شريطة أن تتوفر أدوات علم الوراثة البصرية ذات الصلة ، مثل Cre-driver وopsins floxed.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الدراسة الحالية، نقدم بروتوكولين خطوة بخطوة لكيفية إجراء أنواع مختلفة من تحليلات تفضيل المكان باستخدام علم الوراثة البصرية في الفئران. تم استخدام البروتوكولات المبينة لتقييم الأنماط الظاهرية السلوكية المجزية أو الوافر للخلايا العصبية VTA(الشكل 1 والشكل 6)12، ولكن يمكن استخدامها لاستكشاف الدور السلوكي للخلايا العصبية في مناطق الدماغ الأخرى أيضًا.
وقد وصفت العديد من الدراسات الحديثة نماذج RT-PP في اثنين من المقصورة23،24 وثلاثة أجهزة مقصورة13،14،15، 16،17،18. تصف البروتوكولات الحالية الإعدادات التفصيلية لبروتوكولات RT-PP و NCP في جهاز من ثلاث مقصورات يشبه تلك المستخدمة تقليديًا في تجارب CPP لتقييم الآثار السلوكية على إعطاء أدوية التعاطي. في حين يتم تقديم النتائج هنا فقط كنسبة مئوية من الوقت الذي يقضيه الماوس في كل حجرة ، فإن برنامج التتبع يسمح بتحليل العديد من المعلمات السلوكية الأخرى ، مثل التحولات إلى المناطق والسرعة والوقت الذي يقضيه غير متحرك وأكثر من ذلك. ويمكن أن يكون تحليل البارامترات المختلفة ذات أهمية لتفسير البيانات.
بروتوكولات RT-PP الحالية مرنة ويمكن تعديلها لاختبار ما إذا كانت أنواع مختلفة من أنماط التحفيز لها تأثيرات مجزية. يمكن تغيير معلمات التحكم بالليزر بسهولة إما من خلال البرنامج النصي للوحة المتحكم الدقيق أو داخل برنامج التتبع ، مما يدل على براعة الإعداد. نقترح تردد تحفيز 20 هرتز الذي هو ضمن نطاق، وأحيانا أقل، من الترددات المطبقة في الدراسات السابقة باستخدام نفس البديل opsin (ChR2/H134R) لدراسة الخلايا العصبية الدوبامين والغلوتاماتية ومحطاتها13،14،16،17،18،23،24، 25،26،27. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن ترددات التحفيز العالي يمكن أن يكون لها آثار عكسية على السلوك من الترددات المنخفضة ، وأن هذه الآثار يتم التوسط من خلال كتلة نزع الاستقطاب الناجمة عن الترددات الأعلى28. وبالمثل ، وقد تبين الاختلافات في الإخراج السلوكي عند تحفيز الجلوتاماتال والخلايا العصبية GABAergic في المنطقة قبل البصري الجانبي15. فحصت هذه الدراسات الخلايا العصبية من مناطق مختلفة من VTA ولوحظت أكبر الآثار على الترددات العالية من الخلايا العصبية غير الجلوتامات15،28. ويستند اختيارنا على 20 هرتز على الدراسات السابقة من الخلايا العصبية VTA الجلوتاميتي والدوبامين مما يدل على أنه من خلال ترددات التحفيز المختلفة، لا يتم تغيير المخرجات السلوكية ذات الصلة بالمكافأة بشكل كبير24،26.
معلمة إضافية يمكن تعديلها والتي قد تؤثر على النتيجة التجريبية هي قوة مصدر الضوء. قوة ليزر أعلى يمكن أن تزيد من حجم المنطقة التي تحفز الضوء ، والتي قد تكون مفيدة في بعض أنواع التجارب ولكن مع عيب زيادة في درجة الحرارة5. في الواقع ، أظهرت دراسة حديثة أن الزيادات الناجمة عن الليزر في درجة الحرارة يمكن أن تغير فسيولوجيا الدماغ وتؤثر على القياسات السلوكية29. هذه الملاحظات تسليط الضوء على أهمية إدراج الضوابط السلبية opsin في التصميم التجريبي. في البروتوكول الحالي، استخدمنا 10 mW قوة الليزر التي هي مماثلة، وقد ثبت سابقا أن تكون فعالة في تحفيز الخلايا العصبية الدوبامين والغلوتاماتفية في VTA16،24،26. عند إعداد التجارب ، من المهم الانتباه إلى حجم المنطقة التي توجد فيها الخلايا ذات الاهتمام وخصائص الألياف البصرية وحبل التصحيح (الفتحة العددية ، القطر الأساسي). هذه المعلمات ضرورية لتأخذ في الاعتبار عند إجراء العمليات الحسابية المتعلقة بقوة الليزر. لمزيد من التفاصيل، يمكن استخدام الآلة الحاسبة التي طورها مختبر كارل ديسيروث(http://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php).
التحقق من الهيسولوجية لإعادة تركيب Cre-Lox هو جانب حاسم آخر عند تطبيق تجارب علم الوراثة البصرية. التحقق من كفاءة إعادة التركيب يجب أن يتم دائمًا في مجموعة تجريبية قبل بدء أي تجارب سلوكية في مجموعة كبيرة من الحيوانات. وهذا أمر مهم لأسباب أخلاقية ولكن أيضا للناتج التجريبي الأمثل. قد يظهر كل بناء فيروسي خصوصية متغيرة لأنواع الخلايا العصبية المتميزة وفي مناطق مختلفة5، وهي معلمة يمكن أن تؤثر على التجارب بطرق لا يمكن التنبؤ بها وحتى مضللة. على سبيل المثال، قمنا في السابق بالتحقق من صحة نمط إعادة تركيب Cre-Lox لفيروسات AAV5 في VTA من فئران DAT-Cre ووجدنا أن الحقن الأحادية كانت كافية لاستهداف غالبية منطقة الاهتمام. عندما درسنا بعد ذلك التجمعات الفرعية المقيدة مكانًا داخل VTA ، مثل تلك التي تتميز بتعبير NeuroD6 ، لاحظنا أن الحقن الفيروسية الثنائية كانت أكثر كفاءة لاستهداف عدد أكبر من الخلايا العصبية مما يعطي تأثيرات سلوكية أكثر وضوحًا على التحفيز الضوئي للضوء12. وعلاوة على ذلك، فإن الوقت من الجراحة إلى بدء التجارب السلوكية يجب أن تعالج بعناية. أسبوعين هو الوقت الكافي لبناء الحمض النووي ChR2 أن أعرب في الهيئات الخلية كما نظهر هنا، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى فترات انتظار أطول (~ 8 أسابيع) إذا كان المحقق هو اختبار تأثير التحفيز في مناطق الإسقاط13،14،15،17.
تجدر الإشارة إلى أن حجم الفيروس الذي تم حقنه (في حالتنا 300 nL) قد يكون مناسبًا عند دراسة الخلايا العصبية في VTA ، ولكن يجب تعديل الحجم وtiter اعتمادًا على كفاءة النقل وحجم الهيكل المدروس. بالإضافة إلى ذلك، بالنسبة للهياكل الثنائية الواقعة على مسافة من المحور الاصطلاحي، قد يكون من الضروري إجراء حقن ثنائية، وكذلك زرع الألياف البصرية بشكل ثنائي لضمان التنشيط/التثبيط في نصفي الكرة الأرضية.
وأخيراً، من الضروري دائماً إجراء تحليل النسيج بعد الوفاة للتحقق من كفاءة إعادة تركيب Cre-Lox وتأكيدها والتحقق من موقع الزرع الصحيح للألياف البصرية في الموقع المقصود. غير متوقع، الإفراط في تقييد أو الإفراط في إعادة تركيب الكريلوكس قد يحدث بسبب التوزيع غير معروف للخلايا العصبية التعبير عن كري خارج حدود المنطقة المقصودة، أو بسبب الاختلافات في النمط المصلي الفيروس، وسوء التعامل مع الفيروس، انسداد حقنة لتوصيل الفيروس أو غيرها من المشاكل المتعلقة بالجراحة. يجب إجراء التحقق من إعادة تركيب Cre-Lox المرضية وزرع الألياف البصرية الصحيحة لتأكيد أي نتائج إحصائية للتقييمات السلوكية من أجل استخلاص استنتاجات آمنة.
من حيث البيانات المقدمة هنا كأمثلة على كيفية استخدام النموذجين السلوكيين ، كان من المتوقع تفضيل كبير للجانب المقترن بالضوء الذي تم الحصول عليه عن طريق التحفيز الأوبتوري للخلايا العصبية الدوبامين في VTA من خلال تحليل فئران DAT-Cre في نموذج RT-PP استنادًا إلى النتائج السابقة23،24،25،26،27 في حين لم يكن من المتوقع تجنب هذا الجانب الذي أظهرته الفئران VGLUT2-Cre. وقد ثبت VGLUT2 الخلايا العصبية من VTA وإسقاطاتها أن تشارك في كل من المكافأة والنفور16،17،24،30،31، ولذلك قمنا بتحليل NCP لتقييم سلوك تجنب واضح لوحظ في الإعداد RT-PP الحالي بمزيد من التفصيل. باستخدام الممر الضيق والشفاف كحجرة غير مضاءة فقط لتأكيد الخصائص الوافرة لتحفيز الخلايا العصبية الجلوتامية VTA ، فمن الواضح أنه في هذا الإعداد ثلاثي المقصورة خاصة ، يؤدي التنشيط البوجيني لهذه الخلايا العصبية إلى استجابة وافيرسية. هذه التجارب، التي أظهرت هنا لمثال الحالات التي قد تستفيد من استخدام كل من بروتوكول RT-PP وNCP، كانت جزءا من دراسة نشرت مؤخرا، ويمكن الاطلاع على مجموعة البيانات الكاملة وكذلك المناقشات بشأن هذه النتائج في هذا المنشور12.
بالإضافة إلى NCP ، تتضمن الطرق البديلة لتأكيد النفور الإضاءة القوية لمنطقة داخل منطقة حقل مفتوح أثناء إقران بقية الساحة بتنشيط الليزر ، أو تنفيذ مهمة تجنب نشطة حيث يتعين على الماوس تنفيذ نمط سلوك معين لإنهاء التحفيز بالليزر15.
باختصار، توفر البروتوكولات الموصوفة معلومات هامة حول كيفية إجراء تحليل RT-PP و NCP بنجاح بالطريقة الأكثر كفاءة من أجل كشف دور تنشيط الخلايا العصبية في المكافأة والنفور. اعتمادا على الفرضية العلمية، يمكن تحليل مجموعة من المعلمات باستخدام هذه البروتوكولات، ويمكن أيضا الجمع بين كل بروتوكول مع نماذج أخرى التحقق من صحتها للتحليلات السلوكية الأمثل تنفيذ علم البصريات لمعالجة الدماغ محددة المناطق والخلايا العصبية ذات الأهمية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم الاعتراف بمصادر التمويل لدينا بامتنان: جامعة أوبسالا، Vetenskapsrådet (مجلس البحوث السويدي)، Hjärnfonden، Parkinsonfonden، مؤسسات البحوث من بيرتيل Hållsten، OE & Edla يوهانسون، Zoologisk Forskning وÅhlén. تم الاحتفاظ بالحيوانات في جامعة أوبسالا وأجريت التجارب في المرفق السلوكي لجامعة أوبسالا.
Materials
| AAV-Cre dependent virus | UNC Vector Core | – | a great variety of viruses to suit any project's needs |
| Agarose | VWR Life Science | 443666A | |
| Buffer for PCR | KAPA BIOSYSTEMS | KB1003 | 10x, contains 1.5mM MgCl2 at 1x |
| Bupivacaine (Marcain) | Aspen | N01BB01 | local anesthetic, 5 mg/ml solution, requires prescription |
| Carprofen (Norocarp) | N-Vet | 27636 | anti-inflammatory, analgesic; 50 mg/ml solution, requires prescription |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | 100mM, have to be dilluted to 10mM and mixed |
| DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | SM0243 | 100 bp, 50 μg Gene Ruler |
| DNA loading dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | 6x, dilute to 1x before using |
| Ear puncher | AgnThos | AT7000 | ear puncher to take tissue samples for PCR or to mark animals |
| Fiberoptic patchcords | Doric Lenses | MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25 | |
| Implantable fiberoptics | Doric Lenses | MFC_200/245-0.37_5mm_ZF1.25_FLT | the properties of the fibers might change depending on the experiment |
| Infusion pump for virus injections | AgnThos | Legato 130 | contains remote pump to secure the syringe directly on the stereotexi frame |
| Isoflurane (Forane) | Baxter | N01AB06 | Volatile anesthetic, requires prescription |
| Jewelry screws | AgnThos | MCS1x2 | |
| Laser source | Marwell Laser Systems | CNI MBL-III-473-100mW | |
| Microcontroller board | Arduino | "Uno" board | can be ordered from several companies |
| Microdrill | AgnThos | 1474 | could be ordered with or without stereotaxic holder |
| Needle (34G) | World Precision Instruments | NF36BV | |
| Nucleic Acid gel stain – GelRed | Biotium | 41003-T | |
| PCR tubes | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | |
| Place Preference Apparatus | Panlab | 76-0278 | |
| Rotary joint | Doric Lenses | FRJ_1x1_FC-FC | |
| Sleeves | Doric Lenses | SLEEVE_ZR_1-25 | mating sleeve to connect the patchcord with the implanted optic fiber |
| Stabilization cement | Ivoclar Vivadent | Tetric EvoFlow | |
| Syringe (10ul) | World Precision Instruments | NanoFil | |
| Taq polymerase | KAPA BIOSYSTEMS | KE1000 | 500U |
| TAE buffer | Omega BIO-TEK | SKU:AC10089 | 50x concentration, has to be dilluted before use |
| Thermal cycler | BIO-RAD S1000 | 1852148 | necessary to perfrom PCR reactions |
| Tissue glue | AgnThos | Vetbond | |
| Tracking software | Noldus | Ethovision XT | |
| TTL box | Noldus | Noldus USB-IO box | |
| UV transilluminator | Azure Biosystems | c200 model |
References
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The Development and Application of Optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34 (1), 389-412 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Pupe, S., Wallén-Mackenzie, &. #. 1. 9. 7. ;. Cre-driven optogenetics in the heterogeneous genetic panorama of the VTA. Trends in Neurosciences. 38 (6), 375-386 (2015).
- Spanagel, R. Animal models of addiction. Dialogues in Clinical Neuroscience. 19 (3), 247-258 (2017).
- Tzschentke, T. M. Measuring reward with the conditioned place preference (CPP) paradigm: Update of the last decade. Addiction Biology. 12 (3-4), 227 (2007).
- Hoffman, D. C. The use of place conditioning in studying the neuropharmacology of drug reinforcement. Brain Research Bulletin. 23 (4-5), 373-387 (1989).
- Huston, J. P., Silva, M. A. D. S., Topic, B., Müller, C. P. What’s conditioned in conditioned place preference?. Trends in Pharmacological Sciences. 34 (3), 162-166 (2013).
- Bardo, M. T., Bevins, R. A. Conditioned place preference: What does it add to our preclinical understanding of drug reward?. Psychopharmacology. 153 (1), 31-43 (2000).
- Bimpisidis, Z., et al. The NeuroD6 subtype of VTA neurons contributes to psychostimulant sensitization and behavioral reinforcement. eNeuro. 6 (3), e0066 (2019).
- Root, D. H., Mejias-Aponte, C. A., Qi, J., Morales, M. Role of Glutamatergic Projections from Ventral Tegmental Area to Lateral Habenula in Aversive Conditioning. Journal of Neuroscience. 34 (42), 13906-13910 (2014).
- Steidl, S., Wang, H., Ordonez, M., Zhang, S., Morales, M. Optogenetic excitation in the ventral tegmental area of glutamatergic or cholinergic inputs from the laterodorsal tegmental area drives reward. European Journal of Neuroscience. 45 (4), 559-571 (2017).
- Barker, D. J., et al. Lateral Preoptic Control of the Lateral Habenula through Convergent Glutamate and GABA Transmission. Cell Reports. 21 (7), 1757-1769 (2017).
- Wang, H. L., Qi, J., Zhang, S., Wang, H., Morales, M. Rewarding Effects of Optical Stimulation of Ventral Tegmental Area Glutamatergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 35 (48), 15948-15954 (2015).
- Qi, J., et al. VTA glutamatergic inputs to nucleus accumbens drive aversion by acting on GABAergic interneurons. Nature Neuroscience. 19, 725-733 (2016).
- Qi, J., et al. A glutamatergic reward input from the dorsal raphe to ventral tegmental area dopamine neurons. Nature Communications. 5, 5390 (2014).
- Ekstrand, M. I., et al. Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (4), 1325-1330 (2007).
- Borgius, L., Restrepo, C. E., Leao, R. N., Saleh, N., Kiehn, O. A transgenic mouse line for molecular genetic analysis of excitatory glutamatergic neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 45 (3), 245-257 (2010).
- Papathanou, M., et al. Targeting VGLUT2 in Mature Dopamine Neurons Decreases Mesoaccumbal Glutamatergic Transmission and Identifies a Role for Glutamate Co-release in Synaptic Plasticity by Increasing Baseline AMPA/NMDA Ratio. Frontiers in Neural Circuits. 12, 64 (2018).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2008).
- Tsai, H. C., et al. Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning. Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).
- Yoo, J. H., et al. Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement. Nature Communications. 7, 1-13 (2016).
- Pascoli, V., Terrier, J., Hiver, A., Lüscher, C. Sufficiency of Mesolimbic Dopamine Neuron Stimulation for the Progression to Addiction. Neuron. 88 (5), 1054-1066 (2015).
- Ilango, A., Kesner, A. J., Broker, C. J., Wang, D. V., Ikemoto, S. Phasic excitation of ventral tegmental dopamine neurons potentiates the initiation of conditioned approach behavior: parametric and reinforcement-schedule analyses. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 155 (2014).
- Kim, K. M., et al. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PLoS ONE. 7 (4), 1-8 (2012).
- Kroeger, D., et al. Galanin neurons in the ventrolateral preoptic area promote sleep and heat loss in mice. Nature Communications. 9, 4129 (2018).
- Owen, S. F., Liu, M. H., Kreitzer, A. C. Thermal constraints on in vivo optogenetic manipulations. Nature Neuroscience. 22 (7), 1061-1065 (2019).
- Root, D. H., Estrin, D. J., Morales, M. Aversion or Salience Signaling by Ventral Tegmental Area Glutamate Neurons. iScience. 2, 51-62 (2018).
- Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
