ショウジョウバエメラノガスターにおける軸索死における軸索とそのシナプスの形態学的および機能的評価

PNSにおける軸索死時の軸索形態の観察 翼損傷:軸索束の部分的な損傷 5人の処女女性と5人の男性を右遺伝子型(図4A、P0世代)で使用し、室温(RT)で十字架を行います。0P0を 3 ~ 4 日ごとに新しいバイアルに渡します。毎日、閉鎖されたばかりの成人の子孫(F1世代)を収集し、7〜14日間年齢を重用します。 CO2パッド上のハエを麻酔します。マイクロハサミを使用して、翼の中央に大まかに前翼静脈を切断する(図1A)。一方の翼を怪我に、もう1つの翼を年齢に合わせた怪我のないコントロールとして使用します。翼ごとに1つの怪我を適用し、十分な翼(約15の翼)を負傷させる必要があります。注:翼全体を切り抜くことができますが、前翼静脈のみを切断するだけで十分です。これは翼の最も強い部分です。 ハエを食物含有バイアルで回収する。 軸索の翼解剖と可視化 ガラススライド全体に沿ってピペットを用いて10μLのハロカーボンオイル27を広げる(図1B)。 負傷した場合は、負傷したコントロールウィングを必要な時点(例えば、1日または7日の負傷後)に切り落とします。マイクロハサミを使ってカットし、ピンセットで翼をつかみます。最大4つの翼をハロカーボンオイル27(図1B)に取り付け、カバースライドで覆います。 回転ディスク顕微鏡を使用して、すぐに翼をイメージします。0.33 μmのステップサイズを持つZ軸に沿った一連の光学断面を取得し、zスタックを1つのファイルに圧縮して、その後の解析を行います。注意:細胞のボディと軸索が収容されている前翼の静脈をつかむべきしないでください。中央の翼をつかむ。翼の組織は固定されていません。翼を取り付けるまでの時間を8分以内にイメージングするようにしてください。 図1:翼の軸索死時の軸索形態の観察(A)2つのまばらなGFP標識感覚ニューロンを持つスケマティックフライウィング(以下にも個別に示す)。負傷部位と観察分野が示されている。(B) 翼イメージング用の回路図設定。負傷および無傷のコントロール翼(灰色)は、ガラススライド(水色)にハロカーボンオイル27(赤)に取り付けられ、カバースライド(黒)で覆われています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 2. CNSにおける軸索死時の軸索とシナプス形態の観察 アンテナアブレーション:軸索バンドル全体の損傷 右の遺伝子型から5人の処女女性と5人の男性(図5A、P0世代)を使用してRTでクロス0を行います。毎日、閉鎖されたばかりの成人子孫(F1世代)を収集し、7歳から14日間の年齢をとらせます。 CO2パッド上のハエを麻酔します。ピンセットを使用して、一方的なアブレーションのために右の3番目のアンテナセグメントをアブレーションします。または左右の 3番目のアンテナ セグメントの両方を両側アブレーションに使用します (図 2A-C)。これは、GFP標識ニューロン細胞体を除去し、軸索投影はCNSに残る。注: アンテナ アブレーションは軸索バンドル全体を切断します。一方的なアブレーションが行われる場合、対側側側(未アパックアンテナ)の軸索束が内部制御として機能します。十分なアンテナアブレーション(約15匹)を実行してください。 ハエを食物含有バイアルで回収する。 脳の解剖と軸索の可視化シリコーンエラストマーベース(9 mL)と硬化剤(1 mL)を10:1の体積比で混合します。各5 mL混合物を35mmの組織培養プレートに移し、一晩のヒュームフードで穏やかな攪拌と混合することによって導入される空気を減らします。混合物は24時間以内に固化する。注: 解剖プレートは1回だけ準備する必要があり、複数回使用することができます。 CO2パッド上のハエを麻酔し、必要な時点(例えば、アンテナアブレーションの1または7日後)に2つのピンセットを使用して成人の頭部を切断する。1つのトゥイザーを使用して首をつかみ、もう1つのトゥイザーを使用して胸郭を固定します。首をそっと引っ張り、胸郭から頭を離します。注:目的の数が達成されるまで、CO2パッドに首を切られたヘッドを残しますが、30分以内に次のステップに進んでください。 4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含む固定溶液1mLを含む1.5mLマイクロ遠心分離チューブに、固定溶液に浸したピンセットを使用してリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に0.1%トリトンX-100を入れます。注:フライヘッドは濡れたピンセットによく付きます。マイクロ遠心チューブに容易にすべてのヘッドを移すことを可能にする。 RTで穏やかな攪拌で20分間ヘッドを固定します。氷の上にマイクロ遠心分離管を置くと、ヘッドはマイクロ遠心分離管の底に引き寄せられます。ピペットで上澄み液を取り出し、RTで穏やかな攪拌を伴うPBSで0.1%トリトンX-100を含む洗浄バッファーの1 mLで5つの2分洗浄でこの手順を繰り返し、残留固定溶液を除去する。注:成人ショウジョウバエの脳を解剖する方法に関するビデオは、容易に利用可能です27. ガラスピペットでヘッドを洗浄バッファーで満たされた解剖プレートに移します。1つのトゥイザーを使用して、他のトゥイザーで頭を保持しながら、頭からプロボシスをつかんで引っ張ります。これは、プロボシスが外骨格に取り付けられた穴を残します。 穴と各複合眼の間の外骨格を除去するために2つのピンセットを使用してください。これは、両方のピンセットで頭の構造を開き、内の脳を穏やかに掻き出すことを可能にします。 気管や脂肪を取り除くことによって、各脳を洗浄します(図2D,上)。脳が洗浄されたら、氷の上に洗浄バッファーの1 mLを含む新しいマイクロ遠心チューブに入れます。メモ:損傷または失われた光葉は、脳の中心にある嗅覚ローブに影響を与えない(図2D、上)。 すべての脳が収集され、マイクロ遠心チューブの底に蓄積されたら、洗浄バッファーを固定溶液の1 mLに置き換えます。RTでロッキングで10分間脳を固定し、RTでロッキングして洗浄バッファの1mLに5つの2分の洗浄が続きます。 一次抗体(1:500)を4°Cで揺らしながら一晩洗浄バッファーに適用し、RTでロッキングして1mLの洗浄バッファーを使用して2時間にわたって10回の洗浄を行います。 RTで揺れる洗浄バッファー2時間に二次抗体(1:500)を塗布し、マイクロ遠心分離管をアルミニウム箔で包んで光を遮断する。手順の残りの部分については、マイクロ遠心チューブをアルミホイルで覆ったままにしておきます。RTで揺れ動いて2時間にわたって1mLの洗浄バッファーで10の洗浄を適用します。 上清を取り除き、マイクロ遠心チューブの脳を覆うためにアンチフェード試薬の一滴を使用してください。4°Cで少なくとも30分間脳をインキュベートしてから、取り付けとイメージングの準備をします。 カバー スライドを用意し、ラボ用テープを貼り付け、テープから “T” のような形を切り取ります (図 2D、下)。得られた空間は、脳含有抗フェード試薬28が両方のチャンバに配管される領域として機能する。注:チップの開口部を広げるために、チップの3mmが切断されている20-200 μLピペットチップを使用してください。これは、脳を含む抗フェード試薬をピペットすることが可能になります.慎重にカバースライドで脳をカバーします。 粘土を使用して、2つの小さな偶数ロールを準備します。粘土ロールがガラススライドの高さより高くないことを確認します。粘土ロールをガラススライド(図2D、底)に貼り付けます。粘土ロールの上に脳を含むカバースライドサンドイッチを置きます。注:GFPラベル付き軸索とそのシナプスは、脳の前部にあります。したがって、それらを正面からイメージ化する方が簡単です。しかし、脳は上向きになるか、カバースライドサンドイッチの上を下に向きます。粘土ロールはサンドイッチホルダーとして機能し、イメージング中にサンドイッチを逆さまに反転させることができます。これにより、すべての脳から正面から画像を取得することが可能になります。 共焦点顕微鏡を使用してz軸に沿った一連の光学断面を1.0 μmのステップサイズで取得し、zスタックを1つのファイルに圧縮して後の分析を行い、残りの軸索投影の数を評価します。 図2:脳内の軸索死時の軸索とシナプスの形態の観察(A) GFP ラベルのセルボディ、軸索、シナプスを持つ概略フライヘッドの側面図。(B) GPF標識嗅覚受容体ニューロンとその軸索およびシナプスの高倍率の正面図。セルボディは3番目のアンテナセグメントに収納され、軸索はCNSに投影されます。軸索は、左嗅糸葉の糸球体にシナプスを形成し、中線を越え、逆側嗅覚葉に糸球体にシナプスを形成する。(C)片側アンテナアブレーションを持つフライヘッドの例。トップ:怪我のないコントロール。中央: 3番目のアンテナ セグメントのアブレーション。下: 2番目の (したがって、3rd)アンテナ セグメントのアブレーション。(D) 脳の準備.上:視野に示された嗅覚葉と軸索突起を有する模式的に解剖されたフライ脳。下:脳イメージングのための回路図設定。2つの粘土ロール(緑)はガラススライド(水色)に取り付けられ、フライブレイン(グレー)を含むカバースライドサンドイッチを運びます。脳はアンチフェード試薬(紫色)に取り付けられ、ラボテープ(オレンジ)で囲まれ、2枚のカバースライド(黒)で覆われています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 3. アキソンとシナプス機能の読み出しとして光遺伝学によって誘導されるグルーミング 光遺伝学的セットアップ 暗い部屋で光遺伝学的実験を行う。セットアップが暗闇の中でハエを照らす850 nm赤外線(IR)LEDスポットライト(図3A)、CsChrimsonを表現するニューロンを活性化する660 nmの赤色LEDスポットライト、および700 nmロングパスフィルタを備えたモノクロカメラで構成され、赤色の光が点滅するのを防ぎます。A 3Dプリンタを使用して、直径1cmの小さな円形の挙動チャンバーを生成し、カバースライドで覆い、チャンバーの隣にある赤色のLEDスポットライトに結合した860 nmのエミッタを配置します(図3B)。注: エミッタは、赤い LED スポットライトがオンになっているときに、ニューロンをアクティブにするタイミングを示します。 LEDスポットライトとカメラをチャンバーの上に取り付けます(図3A、C)。 10の間に10のHzの点滅によってニューロンを活性化する。活性化の期間は、実験計画に従って調整することができる。 光遺伝学のためのハエの準備 電子レンジで食べ物を溶かします。食品を冷却した後、固化する前に、エタノール(EtOH)のすべてのトランスレティナルを200μMの最終濃度に加え、すぐに空のバイアルに注ぎます。注:ホットフードにすべての経常食を加えないように、これはあまり効率的な光遺伝学をもたらす可能性があります。 プラグまたは綿のボールで固化食品を含むバイアルをカバーします。アルミホイルでバイアルを包みます。次に、食品含有バイアルを暗い冷たい部屋に保管します。 右の遺伝子型の5人の処女女性と5人の男性(図6A、世代P0)を使用してRTで十0字架を行います。毎日のベースで、差し込みたばかりの成人子孫(世代F1)を収集し、フライフードで200 μMすべてのトランスレチナルを含むアルミニウムで覆われたバイアルで7〜14日間老化させてください。 ハエを食品を含むバイアルから、食べ物のない空のバイアルにタップして収集します。約30sの氷を含む水でバイアルを冷やすと、ハエは眠りに落ちるでしょう。個々のハエをカバースライドで覆われた小さなチャンバーに急速に入れます(図3B)。注:ハエが暖かければすぐに目が覚めます。個々のハエをそれぞれ単一のチャンバーに素早く広げるのが重要です。CO2パッドを避けてハエを麻酔し、これは彼らの行動に影響を与えます。 光遺伝学を実行して、アンテナグルーミングを引き出します。ここで、プロトコルは、赤い光が存在しない30秒、10 Hzで10秒,の赤信号暴露が続く。この手順を合計で3回繰り返し、その後に赤い光が12、29、30,29の間隔を追加して30秒続く。注: このプロトコルは、実験的な設定に従って調整できます。 CO2パッド上の各チャンバーから個々のハエを収集します。触角損傷にさらします。左と右の2ndアンテナセグメントの両方をアスレートします(図2C)。これは、ジョンストンの器官(JO)ニューロンの細胞体を除去し、軸索突起はCNSに残る。200 μM全てのトランスレチナルを含むアルミニウムで覆われたバイアルでハエを回収します。注:光遺伝学によって誘発されるアンテナグルーミングの場合、感覚ニューロン細胞体は第2のアンテナセグメントに収容される(図2C)。 対応する時点(例えば、7日間のポストアンテナアブレーション)で、被験者は別のグルーミングアッセイに飛ぶ(ステップ3.2.4に戻る)。 図3:軸索およびシナプス機能の読み出しとしてグルーミングを誘導する光遺伝学的セットアップ。(A) 光遺伝学に必要な組み立て成分の図。赤外線(IR)LEDスポットライト、カメラおよび赤色LEDスポットライト(それぞれ左から右へ)。詳細な説明を含むコンポーネントは、一覧の一覧を参照してください。(B) IR エミッタを含む動作チャンバのトップビューの図は、赤色の LED スポットライトの活性化を示す。(C) 単一マウント設定の図。2 つの LED スポットライトとカメラにそれぞれ 3 台のマウント設定が必要です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。