Hedefsiz Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Tabanlı Metabolomik Buğday Tanesi Analizi
Summary
Buğday tanemetabolitleri ve lipitlerinin hedeflenmemiş analizi için bir yöntem sunulmuştur. Protokol, pozitif ve negatif elektrosprey iyonizasyon modlarında edinim ile bir asetonnril metabolit çıkarma yöntemi ve ters faz sıvı kromatografi-kütle spektrometresi metodolojisi içerir.
Abstract
Tarım uygulamalarında genler, çevre ve yönetim arasındaki etkileşimlerin anlaşılması, ürün verimi ve kalitesinin daha doğru tahmin ve yönetimine olanak sağlayabilir. Metabolomik veriler, bu etkileşimlerin belirli bir anda okunmasını sağlar ve bir organizmanın biyokimyasal durumu hakkında bilgilendiricidir. Ayrıca, bireysel metabolitler veya metabolitlerin panelleri verim ve kalite tahmini ve yönetimi için hassas biyobelirteçler olarak kullanılabilir. Bitki metabolom fizyolojik özellikleri ve biyomarker keşif içine bir biyokimyasal anlayış için bir fırsat sağlamak çeşitli fizyokimyasal özelliklere sahip küçük moleküllerin binlerce içerdiği tahmin edilir. Bunu kullanmak için, metabolomik araştırmacılar için önemli bir amaç tek bir analiz içinde mümkün olduğunca çok fizikokimyasal çeşitliliğin yakalamaktır. Burada tarlada yetişen buğday tanesinin analizi için sıvı kromatografi-kütle spektrometresi tabanlı hedefsiz metabolomik bir yöntem salıyoruz. Yöntem üçüncü bir mobil faz tanıtmak için sıvı kromatografi quaternary solvent yöneticisi kullanır ve bir lipid-münakaşa gradyanı ile geleneksel ters faz gradyanı birleştirir. Tane hazırlama, metabolit ekstraksiyonu, enstrümantal analiz ve veri işleme iş akışları ayrıntılı olarak açıklanmıştır. İyi kütle doğruluğu ve sinyal tekrarlanabilirliği gözlendi ve yöntemiyonizasyon modu başına biyolojik olarak yaklaşık 500 özellik verdi. Ayrıca buğday çeşitleri arasında anlamlı olarak farklı metabolit ve lipid özelliği sinyalleri belirlendi.
Introduction
Tarımda genler, çevre ve yönetim uygulamaları arasındaki etkileşimlerin anlaşılması, ürün verimi ve kalitesinin daha doğru tahmin ve yönetimine olanak sağlayabilir. Bitki metabolitleri genom, çevre (iklim, yağış vb.) gibi faktörlerden ve tarım ortamında, bitkilerin yönetilme şeklinden (örneğin, gübre, mantar ilacı vb.) etkilenir. Genomun aksine, metabolom tüm bu faktörlerden etkilenir ve bu nedenle metabolomik veriler bu etkileşimlerin belirli bir zamanda biyokimyasal parmak izini sağlar. Metabolomik temelli bir çalışmanın iki amacından biri vardır: birincisi, organizmanın biyokimyasını daha iyi anlamak ve fizyolojiye göre tedirginlik (abiyotik veya biyotik stres) yanıt mekanizmasını açıklamaya yardımcı olmak; ve ikincisi, biyobelirteçleri çalışma altındaki tedirginlikle ilişkilendirmek. Her iki durumda da, bu bilgiye sahip olmanın sonucu, geliştirilmiş verim büyüklüğü ve kalitesi hedefine ulaşmak için daha hassas bir yönetim stratejisidir.
Bitki metabolom çeşitli fizyokimyasal özelliklere sahip küçük moleküllerin binlerce1 içerdiği tahmin edilir. Şu anda, hiçbir metabolomik platformlar (ağırlıklı olarak kütle spektrometresi ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi) tek bir analizde tüm metabolom yakalayabilir. Metabolomun tek bir analitik çalışma içinde mümkün olduğunca geniş bir kapsama alanı sağlayan bu tür tekniklerin (numune hazırlama, metabolit ekstraksiyonu ve analizi) geliştirilmesi, metabolomik araştırmacılar için önemli bir amaçtır. Buğday tanesinin önceki hedeflenmemiş metabolomik analizleri, birden fazla kromatografik ayrım ve edinim kutuplarından elde edilen verileri birleştirmiş ve/veya daha fazla metabolom kapsama alanı için enstrümantasyon almıştır. Ancak, bu örneklerin her modalite için ayrı ayrı hazırlanması ve elde edilmesi gerekmektedir. Örneğin, Beleggia ve ark.2 polar analitlerin GC-MS analizi için türev leştirilmiş bir örnek hazırladı. Das ve ark.3 analizlerinde kapsama alanını iyileştirmek için hem GC hem de LC-MS yöntemlerini kullanmaktadır; ancak, bu yaklaşım genellikle yukarıda açıklandığı gibi ayrı örnek hazırlıkları yanı sıra iki bağımsız analitik platformlar gerektirir. GC-MS2,3,3,4 ve LC-MS3kullanarakbuğday tanelerinin önceki analizleri,GC-MS için 50 ila 412 (55 tanımlı) özellik, kombine GC-MS ve LC-MS için 409 ve LC-MS lipidomik analizi için birkaç bin adet ilerler.5 Tek bir analiz de en az iki mod birleştirerek, genişletilmiş metabolom kapsama sağlanabilir, biyolojik yorumlama zenginliğini artırırken aynı zamanda hem zaman hem de maliyet tasarrufu sunan.
Tersine faz kromatografisi ile lipid türlerinin geniş bir yelpazede verimli ayrılmasına izin vermek için, modern lipidomics metodolojileri genellikle elüsülasyon solvent yüksek oranda izopropanol kullanın6, aksi takdirde kromatografi tarafından çözülmemiş olabilir lipid sınıfları için olanaklar sağlayan. Verimli bir lipid ayrıştırma için, başlangıç mobil faz da çok organik kompozisyondaha yüksektir 7 tipik ters faz kromatografik yöntemler, hangi moleküllerin diğer sınıfları dikkate. Degradenin başlangıcındaki yüksek organik bileşim, bu yöntemleri diğer moleküllerin sınıflarına daha az uygun hale getirir. En önemlisi, ters faz sıvı kromatografisi, çoğunlukla sulu bir bileşimle başlayan ve kromatografinin elüsyon mukavemeti arttıkça organik içerikte artan ikili bir çözücü degradesi kullanır. Bu amaçla, metabolitlerin hem lipid hem de lipid olmayan sınıflarının ayrılmasını tek bir analizde elde etmek için iki yaklaşımı birleştirmeye çalıştık.
Burada, üçüncü bir mobil faz kullanan ve tek bir örnek hazırlama ve bir analitik kolon kullanarak kombine geleneksel ters faz ve lipidomics-uygun kromatografi yöntemi sağlayan bir kromatografik yöntem salıyoruz. Daha önce ağırlıklı olarak klinik metabolomik çalışmalarda uygulanan kalite kontrol önlemleri ve veri filtreleme adımlarının çoğunu benimsedik. Bu yaklaşımlar, yüksek teknik tekrarlanabilirlik ve biyolojik önemi olan sağlam özellikleri belirlemede yararlıdır ve bu kriterleri karşılamayanları hariç tutar. Örneğin, havuzlu QC örnek8,QC düzeltme9,veri filtreleme9,10 ve eksik özellikleri nputasyon tekrar analizi açıklar11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, buğday tanesi nin analizi için LC-MS tabanlı hedeflenmemiş metabolomik bir yöntem salıyoruz. Yöntem, ters faz degradesine üçüncü bir mobil faz getirerek dört kazanım modunu (ters faz ve lipid-amenable ters faz ile pozitif ve negatif iyonizasyon) iki modda birleştirir. Birleşik yaklaşım, iyon polaritesi başına yaklaşık 500 biyolojik olarak ilgili özellik vermiştir ve bunların kabaca yarısı buğday çeşitleri arasındaki yoğunluk açısından önemli ölçüde farklılık göstermiş. Fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Batı Avustralya Premier Tarım ve Gıda Bursu programı (İş Bölümü, Turizm, Bilim ve Yenilik, Batı Avustralya Hükümeti) ve Premier Fellow, Profesör Simon Cook (Merkezi kabul etmek istiyorum Dijital Tarım, Curtin Üniversitesi ve Murdoch Üniversitesi). Saha denemeleri ve tahıl numunesi toplama, Batı Avustralya’nın Bölgeler için Telif Hakları programı hükümeti tarafından desteklendi. Grantley Stainer ve Robert French’i saha denemelerine katkılarından dolayı kabul ediyoruz. NCRIS tarafından finanse edilen Bioplatforms Avustralya ekipman finansmanı için kabul edilmektedir.
Materials
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
- Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
- Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
- Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
- Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
- Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
- Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
- Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
- Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
- Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).
