Análisis de metabolómica basada en cromatografía líquida no dirigida de grano de trigo

Comprender las interacciones entre los genes, el medio ambiente y las prácticas de gestión en la agricultura podría permitir una predicción y gestión más precisas del rendimiento y la calidad de los productos. Los metabolitos vegetales están influenciados por factores como el genoma, el medio ambiente (clima, lluvias, etc.), y en un entorno agrícola, la forma en que se gestionan los cultivos (es decir, la aplicación de fertilizantes, fungicidas, etc.). A diferencia del genoma, el metabolóme está influenciado por todos estos factores y, por lo tanto, los datos metabolómicos proporcionan una huella bioquímica de estas interacciones en un momento determinado. Por lo general, hay uno de los dos objetivos para un estudio basado en metabolómica: en primer lugar, lograr una comprensión más profunda de la bioquímica del organismo y ayudar a explicar el mecanismo de respuesta a la perturbación (estrés abiótico o biótico) en relación con la fisiología; y en segundo lugar, asociar biomarcadores con la perturbación en estudio. En ambos casos, el resultado de tener este conocimiento es una estrategia de gestión más precisa para lograr el objetivo de mejorar el tamaño y la calidad del rendimiento.

Se prevé que el metaboló de la planta contenga miles^{de 1} de moléculas pequeñas con propiedades fisicoquímicas variadas. Actualmente, ninguna plataforma metabolómica (predominantemente espectrometría de masas y espectroscopia de resonancia magnética nuclear) puede capturar todo el metabolóme en un solo análisis. El desarrollo de estas técnicas (preparación de muestras, extracción y análisis de metabolitos), que proporcionan una cobertura lo más grande posible del metaboló metandolo en una sola ejecución analítica, es un objetivo clave para los investigadores metabolómicos. Los análisis metabolómicos no focalizados anteriores del grano de trigo han combinado datos de múltiples separaciones cromatográficas y polaridades de adquisición y/o instrumentación para una mayor cobertura de metabolóme. Sin embargo, esto ha requerido que las muestras se preparen y adquieran por separado para cada modalidad. Por ejemplo, Beleggia et al.² prepararon una muestra derivada para el análisis GC-MS de analitos polares, además del análisis GC-MS de los analitos no polares. ³ utilizaron métodos GC y LC-MS para mejorar la cobertura en sus análisis; sin embargo, este enfoque generalmente requeriría preparaciones de muestras separadas como se describió anteriormente, así como dos plataformas analíticas independientes. Los análisis previos de grano de trigo utilizando GC-MS^2,3,4 y LC-MS^3,5 plataformas han producido 50 a 412 (55 identificados) características para GC-MS, 409 para GC-MS combinado y LC-MS y varios miles para un análisis de lipidómica LC-MS⁵. Mediante la combinación de al menos dos modos en un solo análisis, se puede mantener una cobertura de metabolóme ampliada, aumentando la riqueza de la interpretación biológica y al mismo tiempo ofreciendo ahorros en tiempo y costo.

Para permitir la separación eficiente de una amplia gama de especies de lípidos mediante cromatografía en fase inversa, las metodologías de lipidomics modernas suelen utilizar una alta proporción de isopropanol en el disolvente de elución^6,proporcionando amenabilidad a las clases de lípidos que de otro modo podrían no ser resueltos por la cromatografía. Para una separación eficiente de lípidos, la fase móvil inicial también es mucho mayor en la composición orgánica⁷ que los métodos cromatográficos de fase invertida típicos, que consideran otras clases de moléculas. La alta composición orgánica al comienzo del gradiente hace que estos métodos sean menos adecuados para muchas otras clases de moléculas. Más notablemente, la cromatografía líquida de fase invertida emplea un gradiente de disolvente binario, comenzando con una composición mayormente acuosa y aumentando en contenido orgánico a medida que aumenta la resistencia a la elución de la cromatografía. Con este fin, buscamos combinar los dos enfoques para lograr la separación de las clases de lípidos y no lipídicos de metabolitos en un solo análisis.

Aquí, presentamos un método cromatográfico que utiliza una tercera fase móvil y permite una fase invertida tradicional combinada y un método de cromatografía apropiado para lipidómica utilizando una sola preparación de muestra y una columna analítica. Hemos adoptado muchas de las medidas de control de calidad y pasos de filtrado de datos que se han implementado previamente en estudios metabolómicos predominantemente clínicos. Estos enfoques son útiles para determinar características sólidas con alta reproducibilidad técnica y relevancia biológica y excluyen aquellas que no cumplen estos criterios. Por ejemplo, describimos el análisis de repetición de la muestra de control de calidad agrupada⁸, corrección de QC⁹, filtrado de datos^9,10 e imputación de las características faltantes¹¹.