Нецелевая жидкая хроматография-масс-спектрометрия на основе метаболомики Анализ зерна пшеницы

Понимание взаимосвязей между генами, окружающей средой и практикой управления в сельском хозяйстве может позволить более точнопрогнозировать и управиться выходом и качеством продукции. Метаболиты растений зависят от таких факторов, как геном, окружающая среда (климат, осадки и т.д.), а в сельском хозяйстве управляется тем, как управляются сельскохозяйственные культуры (т.е. применение удобрений, фунгицидов и т.д.). В отличие от генома, метаболом находится под влиянием всех этих факторов и, следовательно, метаболомика данные обеспечивает биохимический отпечаток этих взаимодействий в определенное время. Есть, как правило, одна из двух целей для метаболомики на основе исследования: во-первых, для достижения более глубокого понимания биохимии организма и помочь объяснить механизм реагирования на возмущение (абиотических или биотических стресс) в отношении физиологии; и, во-вторых, связать биомаркеры с исследуемыми возмущениями. В обоих случаях результатом наличия этих знаний является более точная стратегия управления для достижения цели повышения размера и качества урожайности.

По прогнозам, метаболомрастение будет содержать тысячи¹ малых молекул с разнообразными физикохимическими свойствами. В настоящее время никакие платформы метаболомики (преимущественно масс-спектрометрия и ядерная магнитно-резонансная спектроскопия) не могут зафиксировать весь метаболом в одном анализе. Разработка таких методов (подготовка образцов, метаболитная добыча и анализ), которые обеспечивают максимально большое покрытие метаболом, насколько это возможно в рамках одного аналитического запуска, является ключевой целью для исследователей метаболомики. Предыдущие нецелевые метаболомические анализы зерна пшеницы объединили данные из нескольких хроматографических разделений и закупочных полярностей и/или приборов для большего охвата метаболомами. Однако для этого необходимо подготовить и приобрести образцы отдельно для каждого метода. Например, Beleggia et al.² подготовили производный образец для анализа полярных анализов GC-MS в дополнение к анализу GC-MS неполярных анализов неполярных анализов. Das et al.³ использовали как методы GC-, так и LC-MS для улучшения охвата в своих анализах; однако этот подход, как правило, требует отдельной выборочной подготовки, как описано выше, а также двух независимых аналитических платформ. Предыдущие анализы зерна пшеницы с использованием GC-MS^2,,3,,4 и LC-MS^3,,5 платформ дали от 50 до 412 (55 идентифицированных) особенностей для GC-MS, 409 для комбинированных GC-MS и LC-MS и несколько тысяч для анализа липидоми LC-MS⁵. Объединив по крайней мере два режима в единый анализ, расширенный охват метаболом может быть сохранен, увеличивая богатство биологического толкования, а также предлагая экономию как во времени, так и в стоимости.

Для обеспечения эффективного разделения широкого спектра липидных видов путем обратной фазы хроматографии, современные методологии липидоми обычно используют высокую долю изопропанола в растворителе elution⁶, обеспечивая удобство для липидных классов, которые в противном случае могли бы быть нерешенными хроматографии. Для эффективного разделения липидов, начиная передвижная фаза также гораздо выше в органическом составе⁷ чем типичные обратные методы хроматографических фаз, которые рассматривают другие типы молекул. Высокий органический состав в начале градиента делает эти методы менее подходящими для многих других классов молекул. В частности, обратная фаза жидкой хроматографии использует бинарный градиент растворителя, начиная с в основном водного состава и увеличивая органическое содержание по мере увеличения силы растворения хроматографии. С этой целью мы стремились объединить два подхода для достижения разделения как липидных, так и нелипидных классов метаболитов в рамках одного анализа.

Здесь мы представляем хроматографический метод, который использует третью мобильную фазу и позволяет комбинированную традиционную обратную фазу и соответствующий липидомике метод хроматографии с использованием одного образца подготовки и одной аналитической колонки. Мы приняли многие из мер по контролю качества и шагов фильтрации данных, которые ранее были реализованы в преимущественно клинических метаболомических исследованиях. Эти подходы полезны для определения надежных объектов с высокой технической воспроизводимостью и биологической репродукцией и исключают те, которые не отвечают этим критериям. Например, мы описываем повторный анализ объединенной выборки⁸, коррекции КК⁹, фильтрации данных^9,,10 и вычисления отсутствующих функций^11.