Análise de metabolômica baseada em espectrometria líquida não direcionada

Compreender as interações entre genes, meio ambiente e práticas de manejo na agricultura poderia permitir uma previsão e gerenciamento mais precisos do rendimento e da qualidade do produto. Os metabólitos vegetais são influenciados por fatores como o genoma, o ambiente (clima, chuvas etc.), e em um ambiente agrícola, a forma como as culturas são gerenciadas (ou seja, aplicação de fertilizantes, fungicidas etc.). Ao contrário do genoma, o metabolome é influenciado por todos esses fatores e, portanto, os dados metabolômicos fornecem uma impressão digital bioquímica dessas interações em um determinado momento. Geralmente, há uma das duas metas para um estudo baseado em metabolômica: em primeiro lugar, obter uma compreensão mais profunda da bioquímica do organismo e ajudar a explicar o mecanismo de resposta à perturbação (estresse abiótico ou biótico) em relação à fisiologia; e, em segundo lugar, associar biomarcadores com a perturbação em estudo. Em ambos os casos, o resultado de ter esse conhecimento é uma estratégia de gestão mais precisa para alcançar o objetivo de melhorar o tamanho e a qualidade do rendimento.

Prevê-se que o metabolome da planta contenha milhares de^pequenas moléculas com variadas propriedades físico-químicas. Atualmente, nenhuma plataforma metabolômica (espectrometria de massa predominantemente e espectroscopia de ressonância magnética nuclear) pode capturar todo o metabolome em uma única análise. Desenvolver tais técnicas (preparação da amostra, extração e análise metabólica), que fornecem a maior cobertura possível do metabolome dentro de uma única corrida analítica, é um objetivo fundamental para os pesquisadores de metabolômica. Análises metabolômicas não direcionadas anteriores de grãos de trigo combinaram dados de múltiplas separações cromatográficas e polaridades de aquisição e/ou instrumentação para maior cobertura metabolome. No entanto, isso exigiu que as amostras fossem preparadas e adquiridas separadamente para cada modalidade. Por exemplo, Beleggia et al.² prepararam uma amostra derivatizada para a análise de ánlytes polares gc-ms, além da análise gc-ms dos analytes não polares. Das et al.³ utilizaram métodos GC e LC-MS para melhorar a cobertura em suas análises; no entanto, essa abordagem exigiria geralmente preparações amostrais separadas como descrito acima, bem como duas plataformas analíticas independentes. Análises anteriores de grãos de trigo utilizando GC-MS^{3,5 2,,3,,4} e LC-MS 3 , 5 plataformas produziram 50 a 412 (55 identificados) recursos para GC-MS, 409 para GC-MS e LC-MS combinados e vários milhares para análise de lipidomia slc-MS⁵. Ao combinar pelo menos dois modos em uma única análise, a cobertura metabolome estendida pode ser mantida, aumentando a riqueza da interpretação biológica e, ao mesmo tempo, oferecendo economia tanto no tempo quanto no custo.

Para permitir a separação eficiente de uma ampla gama de espécies lipídicas por cromatografia de fase invertida, as metodologias de lipidomia modernas geralmente utilizam uma alta proporção de isopropanol no solvente de elução⁶, proporcionando amenidade às classes lipídicas que poderiam ser não resolvidas pela cromatografia. Para uma separação lipídica eficiente, a fase móvel inicial também é muito maior na composição orgânica⁷ do que os métodos cromatográficos de fase invertidos típicos, que consideram outras classes de moléculas. A alta composição orgânica no início do gradiente torna esses métodos menos adequados para muitas outras classes de moléculas. Mais notavelmente, a cromatografia líquida de fase invertida emprega um gradiente binário solvente, começando com uma composição principalmente aquosa e aumentando em conteúdo orgânico à medida que a força de eluição da cromatografia é aumentada. Para tanto, buscou-se combinar as duas abordagens para alcançar a separação das classes lipídicas e não lipídicas de metabólitos em uma única análise.

Aqui, apresentamos um método cromatográfico que utiliza uma terceira fase móvel e permite um método de cromatografia de fase reversa e lipidomics adequado à lipidomia usando uma única preparação de amostra e uma coluna analítica. Adotamos muitas das medidas de controle de qualidade e etapas de filtragem de dados que já foram implementadas em estudos de metabolômica predominantemente clínica. Essas abordagens são úteis na determinação de características robustas com alta reprodutibilidade técnica e relevância biológica e excluem aquelas que não atendem a esses critérios. Por exemplo, descrevemos a repetição da amostra de QC agrupada⁸, correção QC⁹, filtragem de dados^9,,10 e imputação de recursos ausentes¹¹.