Analisi metabolomica a base di cromomia liquida non mirata del grano di grano di grano

Comprendere le interazioni tra geni, ambiente e pratiche di gestione in agricoltura potrebbe consentire una previsione e una gestione più accurate della resa e della qualità dei prodotti. I metaboliti delle piante sono influenzati da fattori quali il genoma, l’ambiente (clima, precipitazioni, ecc.), e in un ambiente agricolo, il modo in cui vengono gestite le colture (cioè l’applicazione di fertilizzanti, fungicidi ecc.). A differenza del genoma, il metaboloma è influenzato da tutti questi fattori e quindi i dati metabolomici forniscono un’impronta biochimica di queste interazioni in un determinato momento. Di solito ci sono uno dei due obiettivi per uno studio basato sulla metabolomica: in primo luogo, per ottenere una comprensione più profonda della biochimica dell’organismo e aiutare a spiegare il meccanismo di risposta alla perturbazione (stress abiotico o biotico) in relazione alla fisiologia; e in secondo luogo, associare i biomarcatori alla perturbazione in esame. In entrambi i casi, il risultato di avere queste conoscenze è una strategia di gestione più precisa per raggiungere l’obiettivo di migliorare le dimensioni e la qualità della resa.

Si prevede che il metaboloma vegetale contenga migliaia¹ di piccole molecole con varie proprietà fisiochimiche. Attualmente, nessuna piattaforma metabolomica (prevalentemente spettrometria di massa e spettroscopia a risonanza magnetica nucleare) può catturare l’intero metaboloma in un’unica analisi. Lo sviluppo di tali tecniche (preparazione del campione, estrazione e analisi dei metaboliti), che forniscono il più grande copertura possibile del metaboloma all’interno di una singola corsa analitica, è un obiettivo chiave per i ricercatori di metabolomica. Precedenti analisi metabolomiche non mirate del grano di grano hanno combinato i dati provenienti da più separazioni cromatografiche e polarità di acquisizione e/o strumentazione per una maggiore copertura del metaboloma. Tuttavia, ciò ha richiesto la preparazione e l’acquisizione separata dei campioni per ogni modalità. Ad esempio, Beleggia et al.² ha preparato un campione derivatato per l’analisi GC-MS degli analiti polari oltre all’analisi GC-MS degli analiti non polari. ³ ha utilizzato metodi GC e LC-MS per migliorare la copertura nelle loro analisi; tuttavia, questo approccio richiederebbe in genere preparazioni di campioni separati, come descritto in precedenza, nonché due piattaforme analitiche indipendenti. Precedenti analisi del grano di grano con GC-MS^2,3,4 e LC-MS^3,,5 piattaforme hanno prodotto 50 a 412 (55 identificati) caratteristiche per GC-MS, 409 per GC-MS combinato e LC-MS e diverse migliaia per un’analisi lipidomica LC-MS⁵. Combinando almeno due modalità in un’unica analisi, è possibile mantenere una copertura estesa del metaboloma, aumentando la ricchezza dell’interpretazione biologica e offrendo anche risparmi in termini di tempo e costi.

Per consentire l’efficiente separazione di un’ampia gamma di specie lipidiche mediante cromatografia in fase invertita, le moderne metodologie lipidomiche utilizzano comunemente un’alta percentuale di isopropanolo nel solvente elution⁶, fornendo l’asbilità alle classi lipidiche che altrimenti potrebbero essere irrisolte dalla cromatografia. Per un’efficiente separazione dei lipidi, la fase mobile iniziale è anche molto più alta nella composizione organica⁷ rispetto ai tipici metodi cromatografici a fase invertita, che considerano altre classi di molecole. L’alta composizione organica all’inizio del gradiente rende questi metodi meno adatti a molte altre classi di molecole. In particolare, la cromatografia liquida di fase invertita utilizza un gradiente di solvente binario, a partire da una composizione per lo più acquosa e aumentando nel contenuto organico con l’aumentare della forza di eluizione della cromatografia. A tal fine, abbiamo cercato di combinare i due approcci per ottenere la separazione delle classi lipidiche e non lipidiche dei metaboliti all’interno di una singola analisi.

Qui, presentiamo un metodo cromatografico che utilizza una terza fase mobile e consente una fase invertita tradizionale combinata e un metodo di cromatografia appropriata alla lipomica utilizzando una preparazione di un singolo campione e una colonna analitica. Abbiamo adottato molte delle misure di controllo della qualità e dei passaggi di filtraggio dei dati che sono stati precedentemente implementati in studi prevalentemente clinici sulla metabolomica. Questi approcci sono utili per determinare caratteristiche robuste con elevata riproducibilità tecnica e rilevanza biologica ed esclude quelle che non soddisfano questi criteri. Ad esempio, vengono descritte l’analisi ripetuta dell’esempio QC in pool⁸, la correzione QC⁹, il filtraggio dei dati^9,10 e l’imputazione delle funzionalità mancanti¹¹.