Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide
Summary
Eine Methode zur ungezielten Analyse von Weizenkornmetaboliten und Lipiden wird vorgestellt. Das Protokoll umfasst eine Acetonit-Metabolit-Extraktionsmethode und eine umgekehrte Phase-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Methodik mit Erfassung in positiven und negativen Elektrospray-Ionisationsmodi.
Abstract
Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Genen, der Umwelt und dem Management in der landwirtschaftlichen Praxis könnte eine genauere Vorhersage und Verwaltung von Produktertrag und -qualität ermöglichen. Metabolomics-Daten liefern ein Auslesen dieser Wechselwirkungen zu einem bestimmten Zeitpunkt und sind informativ über den biochemischen Status eines Organismus. Darüber hinaus können einzelne Metaboliten oder Metaboliten-Panels als präzise Biomarker für ertrags- und Qualitätsvorhersage und -management verwendet werden. Das pflanzliche Metabolom wird voraussichtlich Tausende von kleinen Molekülen mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften enthalten, die eine Chance für einen biochemischen Einblick in physiologische Eigenschaften und Biomarker-Entdeckung bieten. Um dies zu nutzen, besteht ein zentrales Ziel für Die Forscher der Metabolomik darin, so viel wie möglich von der physikalisch-chemischen Vielfalt in einer einzigen Analyse zu erfassen. Hier stellen wir eine flüssige Chromatographie-Massenspektrometrie-basierte ungezielte Metabolomik-Methode zur Analyse von Feldweizenkorn vor. Das Verfahren nutzt den quaternären Lösungsmittelmanager des Flüssigchromatographen, um eine dritte mobile Phase einzuführen und kombiniert einen traditionellen umgedrehten Phasengradienten mit einem lipidfreundlichen Gradienten. Getreideaufbereitung, Metabolitenextraktion, instrumentelle Analyse und Datenverarbeitungs-Workflows werden ausführlich beschrieben. Es wurden eine gute Massengenauigkeit und Signalreproduzierbarkeit beobachtet, und die Methode ergab etwa 500 biologisch relevante Merkmale pro Ionisationsmodus. Darüber hinaus wurden signifikant unterschiedliche Metaboliten- und Lipid-Feature-Signale zwischen Weizensorten bestimmt.
Introduction
Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Genen, Umwelt und Managementpraktiken in der Landwirtschaft könnte eine genauere Vorhersage und Verwaltung von Produktertrag und -qualität ermöglichen. Pflanzenmetaboliten werden durch Faktoren wie Genom, Umwelt (Klima, Niederschlag usw.) und in einer landwirtschaftlichen Umgebung beeinflusst, wie Pflanzen bewirtschaftet werden (d. h. Die Anwendung von Düngemitteln, Fungizid usw.). Im Gegensatz zum Genom wird das Metabolom durch all diese Faktoren beeinflusst und daher liefern Metabolomik-Daten einen biochemischen Fingerabdruck dieser Wechselwirkungen zu einem bestimmten Zeitpunkt. Es gibt in der Regel eines von zwei Zielen für eine Metabolomik-basierte Studie: erstens, um ein tieferes Verständnis der Biochemie des Organismus zu erreichen und helfen, den Mechanismus der Reaktion auf Störungen (abiotischen oder biotischen Stress) in Bezug auf die Physiologie zu erklären; und zweitens, Biomarker mit der untersuchten Störung in Verbindung zu bringen. In beiden Fällen ist das Ergebnis dieses Wissens eine präzisere Managementstrategie, um das Ziel einer verbesserten Ertragsgröße und -qualität zu erreichen.
Das Pflanzenmetabolom wird voraussichtlich Tausende von1 kleinen Molekülen mit verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften enthalten. Derzeit können keine Metabolomik-Plattformen (vorwiegend Massenspektrometrie und Kernspinresonanzspektroskopie) das gesamte Metabolom in einer einzigen Analyse erfassen. Die Entwicklung solcher Techniken (Probenvorbereitung, Metabolitenextraktion und -analyse), die eine möglichst große Abdeckung des Metaboloms innerhalb eines einzigen analytischen Laufs bieten, ist ein zentrales Ziel für Forscher der Metabolomik. Frühere ungezielte Metabolomik-Analysen von Weizengetreide haben Daten aus mehreren chromatographischen Trennungen und Erfassungspolaritäten und/oder Instrumenten für eine größere Metabolomabdeckung kombiniert. Dies erforderte jedoch, dass Proben für jede Modalität einzeln vorbereitet und erworben wurden. So erstellten Beleggia et al.2. 2 zusätzlich zur GC-MS-Analyse der unpolaren Analyten eine derivatisierte Probe für die GC-MS-Analyse von Polaranalyten. Das et al.3 verwendete sowohl GC- als auch LC-MS-Methoden, um die Abdeckung in ihren Analysen zu verbessern; Dieser Ansatz würde jedoch in der Regel getrennte Probenvorbereitungen wie oben beschrieben sowie zwei unabhängige Analyseplattformen erfordern. Frühere Analysen von Weizengetreide mit GC-MS2,3,4 und LC-MS3,5 Plattformen haben 50 bis 412 (55 identifizierte) Funktionen für GC-MS, 409 für kombinierte GC-MS und LC-MS und mehrere tausend für eine LC-MS Lipidomik-Analyse5ergeben. Durch die Kombination von mindestens zwei Modi in einer einzigen Analyse kann eine erweiterte Metabolomabdeckung aufrechterhalten werden, wodurch der Reichtum der biologischen Interpretation erhöht wird und gleichzeitig Zeit- und Kosteneinsparungen erzielt werden.
Um eine effiziente Trennung einer Vielzahl von Lipidarten durch umgekehrte Phasenchromatographie zu ermöglichen, verwenden moderne Lipidomik-Methoden häufig einen hohen Anteil an Isopropanol im Elutionslösungsmittel6, um Lipidklassen, die sonst durch die Chromatographie ungelöst sein könnten, eine Aenbarkeit zu bieten. Für eine effiziente Lipidtrennung ist die startende mobile Phase auch in der organischen Zusammensetzung7 viel höher als die typischen chromatographischen Methoden der umgekehrten Phase, die andere Klassen von Molekülen berücksichtigen. Die hohe organische Zusammensetzung zu Beginn des Gradienten macht diese Methoden weniger geeignet für viele andere Klassen von Molekülen. Vor allem die umgekehrte Phasenflüssigkeitschromatographie verwendet einen binären Lösungsmittelgradienten, beginnend mit einer meist wässrigen Zusammensetzung und einer Erhöhung des organischen Gehalts, da die Elutionsfestigkeit der Chromatographie erhöht wird. Zu diesem Zweck haben wir versucht, die beiden Ansätze zu kombinieren, um die Trennung von Lipid- und Nicht-Lipid-Klassen von Metaboliten in einer einzigen Analyse zu erreichen.
Hier stellen wir eine chromatographische Methode vor, die eine dritte mobile Phase verwendet und eine kombinierte traditionelle umgekehrte Phase und lipidomics-geeignete Chromatographiemethode mit einer einzigen Probenvorbereitung und einer analytischen Spalte ermöglicht. Wir haben viele der Qualitätskontrollmaßnahmen und Datenfilterschritte übernommen, die bisher in überwiegend klinischen Metabolomik-Studien umgesetzt wurden. Diese Ansätze sind nützlich, um robuste Merkmale mit hoher technischer Reproduzierbarkeit und biologischer Relevanz zu bestimmen, und schließen diejenigen aus, die diese Kriterien nicht erfüllen. Zum Beispiel beschreiben wir die Wiederholungsanalyse der gepoolten QC-Probe8, QC-Korrektur9, Datenfilterung9,10 und Imputation fehlender Features11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir eine LC-MS-basierte ungezielte Metabolomik-Methode zur Analyse von Weizengetreide vor. Die Methode kombiniert vier Erfassungsmodi (umgekehrte Phase und lipid-amenable reversed phase mit positiver und negativer Ionisation) in zwei Modi, indem eine dritte mobile Phase in den umgekehrten Phasenverlauf eingeführt wird. Der kombinierte Ansatz ergab etwa 500 biologisch relevante Merkmale pro Ionenpolarität, wobei etwa die Hälfte dieser signifikant unterschiedlichen Intensitäten zwischen Weizensorten aufwei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten das Landwirtschafts- und Ernährungsstipendium des West australian Premier (Department of Jobs, Tourism, Science and Innovation, Government of Western Australia) und den Premier es Fellow, Professor Simon Cook (Centre for Digitale Landwirtschaft, Curtin University und Murdoch University). Feldversuche und Getreideprobenentnahme wurden von der Regierung des Programms Royalties for Regions in Westaustralien unterstützt. Wir würdigen Grantley Stainer und Robert French für ihre Beiträge zu Feldversuchen. Die von NCRIS finanzierten Bioplattformen Australien sind für die Finanzierung von Ausrüstungen anerkannt.
Materials
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
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