Chromatographie liquide non ciblée-Analyse métabolomique basée sur la spectrométrie de masse du grain de blé

Comprendre les interactions entre les gènes, l’environnement et les pratiques de gestion dans l’agriculture pourrait permettre une prévision et une gestion plus précises du rendement et de la qualité des produits. Les métabolites végétaux sont influencés par des facteurs tels que le génome, l’environnement (climat, précipitations, etc.) et dans un contexte agricole, la façon dont les cultures sont gérées (c.-à-d. l’épandage d’engrais, les fongicides, etc.). Contrairement au génome, le métabolome est influencé par tous ces facteurs et donc les données métabololomics fournit une empreinte biochimique de ces interactions à un moment donné. Il y a habituellement l’un des deux objectifs d’une étude basée sur la métabolomique : premièrement, pour parvenir à une compréhension plus profonde de la biochimie de l’organisme et aider à expliquer le mécanisme de réponse à la perturbation (stress abiotique ou biotique) par rapport à la physiologie; et deuxièmement, associer les biomarqueurs à la perturbation à l’étude. Dans les deux cas, le résultat de cette connaissance est une stratégie de gestion plus précise pour atteindre l’objectif d’améliorer la taille et la qualité des rendements.

Le métabolome végétal devrait contenir des milliers^de petites molécules aux propriétés physicochimiques variées. À l’heure actuelle, aucune plateforme de métabololomie (principalement la spectrométrie de masse et la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire) ne peut capturer le métabolome entier en une seule analyse. Le développement de ces techniques (préparation d’échantillons, extraction et analyse de métabolites), qui fournissent une couverture aussi importante que possible du métabolome au sein d’une seule série analytique, est un objectif clé pour les chercheurs en métaabolomique. Les analyses médabolomics non ciblées antérieures du grain de blé ont combiné les données de multiples séparations chromatographiques et les polarités d’acquisition et/ou l’instrumentation pour une plus grande couverture métabolome. Toutefois, cela a exigé que les échantillons soient préparés et acquis séparément pour chaque modalité. Par exemple, Beleggia et coll.² ont préparé un échantillon dérivatisé pour l’analyse GC-MS des analytes polaires en plus de l’analyse GC-MS des analytes nonpolaires. Das et coll.³ ont utilisé des méthodes GC- et LC-MS pour améliorer la couverture dans leurs analyses; toutefois, cette approche nécessiterait généralement des préparations d’échantillons distinctes telles que décrites ci-dessus ainsi que deux plates-formes d’analyse indépendantes. Les analyses antérieures des céréales de blé à l’aide de GC-MS^2,3,4 et LC-MS^3,5 plates-formes ont donné 50 à 412 (55 identifiés) caractéristiques pour GC-MS, 409 pour les plates-formes combinées GC-MS et LC-MS et plusieurs milliers pour une analyse lipidomicique LC-MS⁵. En combinant au moins deux modes en une seule analyse, une couverture métabolome étendue peut être maintenue, augmentant la richesse de l’interprétation biologique tout en offrant des économies dans le temps et le coût.

Pour permettre la séparation efficace d’un large éventail d’espèces lipidiques par chromatographie de phase inversée, les méthodologies lipidiques modernes utilisent généralement une forte proportion d’isopropanol dans le solvant d’elution⁶, fournissant une commodité aux classes lipidiques qui pourraient autrement ne pas être résolues par la chromatographie. Pour une séparation efficace des lipides, la phase mobile de départ est également beaucoup plus élevée dans la composition organique⁷ que les méthodes chromatographiques de phase inversée typiques, qui considèrent d’autres classes de molécules. La composition organique élevée au début du gradient rend ces méthodes moins adaptées à de nombreuses autres classes de molécules. Plus particulièrement, la chromatographie liquide de phase inversée emploie un gradient de solvant binaire, commençant par une composition principalement aqueuse et augmentant dans la teneur organique pendant que la force d’elution de la chromatographie est augmentée. À cette fin, nous avons cherché à combiner les deux approches pour parvenir à la séparation des classes de lipides et non-lipidiques des métabolites au sein d’une seule analyse.

Ici, nous présentons une méthode chromatographique qui utilise une troisième phase mobile et permet une phase inversée traditionnelle combinée et une méthode de chromatographie lipidique appropriée à l’aide d’une seule préparation d’échantillon et d’une colonne analytique. Nous avons adopté bon nombre des mesures de contrôle de la qualité et des étapes de filtrage des données qui ont déjà été mises en œuvre dans des études méabolomics principalement cliniques. Ces approches sont utiles pour déterminer les caractéristiques robustes avec une recrétabilité technique élevée et la pertinence biologique et exclut celles qui ne répondent pas à ces critères. Par exemple, nous décrivons l’analyse répétée de l’échantillon⁸, qc correction^9,données filtrant^9,10 et l’imputation des entités manquantes¹¹.