Ongerichte vloeibare chromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde metabolomics analyse van tarwekorrel

Inzicht in de interacties tussen genen, omgeving en management praktijken in de landbouw zou kunnen toestaan dat een nauwkeurigere voorspelling en beheer van de opbrengst en kwaliteit van het product. Plantenmetabolieten worden beïnvloed door factoren zoals het genoom, het milieu (klimaat, regenval, enz.), en in een landbouwomgeving, de manier waarop gewassen worden beheerd (d.w.z. toepassing van kunstmest, fungicide enz.). In tegenstelling tot het genoom wordt het metabolome beïnvloed door al deze factoren en daarom biedt metabolomics gegevens een biochemische vingerafdruk van deze interacties op een bepaald moment. Er zijn meestal een van de twee doelen voor een metabolomics-gebaseerde studie: ten eerste om een dieper begrip van de biochemie van het organisme te bereiken en te helpen verklaren het mechanisme van de reactie op verstoring (abiotische of biotische stress) in relatie tot de fysiologie; en ten tweede, om biomarkers te associëren met de verstoring in studie. In beide gevallen is het resultaat van het hebben van deze kennis een nauwkeurigere managementstrategie om het doel van een betere rendementsgrootte en kwaliteit te bereiken.

De plant metabolome wordt voorspeld dat duizenden¹ van kleine moleculen met gevarieerde fysischchemische eigenschappen bevatten. Momenteel kunnen geen metabolomics platforms (voornamelijk massaspectrometrie en nucleaire magnetische resonantie spectroscopie) het hele metabolome in één analyse vastleggen. Het ontwikkelen van dergelijke technieken (monstervoorbereiding, metabolietextractie en -analyse), die een zo groot mogelijke dekking van het metabolome binnen één enkele analytische run bieden, is een belangrijk doel voor metabolomics onderzoekers. Eerdere ongerichte metabolomics analyses van tarwekorrel hebben gegevens gecombineerd van meerdere chromatografische scheidingen en acquisitiepolariteiten en/of instrumentatie voor een grotere metabolomedekking. Hiervoor moeten echter monsters voor elke modaliteit afzonderlijk worden bereid en verworven. Beleggia et al.² hebben bijvoorbeeld een gederivatiseerde steekproef voorbereid voor de GC-MS-analyse van polaire analyten naast de GC-MS-analyse van de niet-polaire analyten. Das et al.³ gebruikten zowel GC- als LC-MS-methoden om de dekking in hun analyses te verbeteren; Deze aanpak vereist echter over het algemeen afzonderlijke monsterpreparaten zoals hierboven beschreven, evenals twee onafhankelijke analytische platforms. Eerdere analyses van tarwekorrel met GC-MS^2,3,4 en LC-MS^3,5 platforms hebben 50 tot 412 (55 geïdentificeerde) functies opgeleverd voor GC-MS, 409 voor gecombineerde GC-MS en LC-MS en enkele duizenden voor een LC-MS lipidomics analyse⁵. Door ten minste twee modi te combineren in één analyse, kan een uitgebreide metabolomedekking worden gehandhaafd, waardoor de rijkdom van biologische interpretatie toeneemt en tegelijkertijd besparingen in zowel tijd als kosten worden bespaard.

Om de efficiënte scheiding van een breed scala van lipidesoorten door omgekeerde-fase chromatografie mogelijk te maken, gebruiken moderne lipidomics methodologieën vaak een hoog percentage isopropanol in het elutionoplosmiddel⁶, die beakeerbaarheid aan lipideklassen verstrekt die anders door de chromatografie zouden kunnen worden onopgelost. Voor een efficiënte lipidescheiding is de beginmobiele fase ook veel hoger in organische samenstelling⁷ dan de typische omgekeerde fasechromatografische methoden, die andere klassen van moleculen overwegen. De hoge organische samenstelling aan het begin van de gradiënt maakt deze methoden minder geschikt voor vele andere klassen van moleculen. Met name, omgekeerde fase vloeibare chromatografie maakt gebruik van een binaire oplosmiddel gradiënt, te beginnen met een meestal waterige samenstelling en toenemende organische inhoud als de elutie sterkte van de chromatografie wordt verhoogd. Hiertoe probeerden we de twee benaderingen te combineren om de scheiding van zowel lipide- als niet-lipideklassen van metabolieten binnen één analyse te bereiken.

Hier presenteren we een chromatografische methode die een derde mobiele fase gebruikt en een gecombineerde traditionele omgekeerde fase en lipidomics-geschikte chromatografiemethode mogelijk maakt met behulp van een enkele monstervoorbereiding en één analytische kolom. We hebben veel van de kwaliteitscontrolemaatregelen en gegevensfilterstappen genomen die eerder zijn geïmplementeerd in voornamelijk klinische metabolomics studies. Deze benaderingen zijn nuttig bij het bepalen van robuuste kenmerken met een hoge technische reproduceerbaarheid en biologische relevantie en sluiten degenen uit die niet aan deze criteria voldoen. We beschrijven bijvoorbeeld herhaalde analyse van het samengevoegde QC-monster⁸, QC-correctie^9,gegevensfiltering^9,10 en toerekening van ontbrekende functies¹¹.