تحليل الموجات الاختزالية السائلة غير المستهدفة - قياس الطيف الشامل - Metabolomics من حبوب القمح
Summary
يتم تقديم طريقة للتحليل غير المستهدف لاستقلاب حبوب القمح والدهون. ويتضمن البروتوكول طريقة استخراج المستقلب الأسيتونتريل وعكس مرحلة منهجية قياس الطيف اللوني الشامل السائل، مع اكتساب في أوضاع التأيّن الكهربائي الإيجابية والسلبية.
Abstract
ويمكن أن يتيح فهم التفاعلات بين الجينات والبيئة والإدارة في الممارسة الزراعية التنبؤ والإدارة الأكثر دقة لغلة المنتجات وجودتها. توفر بيانات Metabolomics قراءة لهذه التفاعلات في لحظة معينة من الزمن وغنية بالمعلومات عن حالة الكائن الحي الكيميائية الحيوية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الأيض الفردية أو لوحات من الأيض كعلامات حيوية دقيقة للتنبؤ والجودة والإدارة. ومن المتوقع أن يحتوي الميتابولوم النباتي على آلاف الجزيئات الصغيرة ذات الخصائص الفيزيائية الكيميائية المتنوعة التي توفر فرصة للحصول على نظرة حيوية كيميائية في الصفات الفسيولوجية واكتشاف العلامات الحيوية. لاستغلال هذا ، والهدف الرئيسي للباحثين metabolomics هو التقاط أكبر قدر ممكن من التنوع الفيزيائي الكيميائي في تحليل واحد. هنا نقدم طريقة قياس الطيف اللوني السائل القائم على الكتلة غير المستهدفة لتحليل حبوب القمح المزروعة في الحقل. تستخدم الطريقة مدير المذيبات الرباعية اللوني السائل لإدخال مرحلة متنقلة ثالثة وتجمع بين تدرج المرحلة المعكوسة التقليدية مع تدرج الدهون القابلة للاستبدال. يتم وصف إعداد الحبوب واستخراج المستقلب والتحليل الآلي وسير عمل معالجة البيانات بالتفصيل. ولوحظت دقة جيدة للكتلة وقابلية استنساخ الإشارة، وأسفرت الطريقة عن حوالي 500 من السمات ذات الصلة بيولوجياً لكل وضع تأيّن. علاوة على ذلك ، تم تحديد المستقلب وإشارات ميزة الدهون المختلفة بشكل كبير بين أصناف القمح.
Introduction
ويمكن أن يتيح فهم التفاعلات بين الجينات والبيئة والممارسات الإدارية في الزراعة التنبؤ والإدارة الأكثر دقة لغلة المنتجات وجودتها. تتأثر الأيض النباتية بعوامل مثل الجينوم والبيئة (المناخ وهطول الأمطار وما إلى ذلك) ، وفي البيئة الزراعية ، تتم إدارة المحاصيل (أي استخدام الأسمدة ومبيدات الفطريات وما إلى ذلك). على عكس الجينوم ، يتأثر metabolome بكل هذه العوامل ، وبالتالي توفر بيانات metabolomics بصمة كيميائية حيوية لهذه التفاعلات في وقت معين. عادة ما يكون هناك واحد من هدفين لدراسة تستند إلى metabolomics: أولاً ، لتحقيق فهم أعمق للكيمياء الحيوية للكائن الحي والمساعدة في شرح آلية الاستجابة للاضطراب (الإجهاد اللاأحيائي أو الحيوي) فيما يتعلق بعلم وظائف الأعضاء ؛ أولاً ، تحقيق فهم أعمق للكيمياء الحيوية للكائن الحي والمساعدة في شرح آلية الاستجابة للاضطراب (الإجهاد اللاأحيائي أو الحيوي) فيما يتعلق بعلم وظائف الأعضاء . وثانيا، لربط المؤشرات الحيوية مع الاضطرابات قيد الدراسة. وفي كلتا الحالتين، فإن نتيجة الحصول على هذه المعرفة هي استراتيجية إدارية أكثر دقة لتحقيق هدف تحسين حجم الغلة ونوعيتها.
ومن المتوقع أن يحتوي الميتابولوم النباتي على الآلاف1 من الجزيئات الصغيرة ذات الخصائص الفيزيائية الكيميائية المتنوعة. حاليا، لا يمكن لمنصات metabolomics (قياس الطيف الكتلي في الغالب والطيف المغناطيسي النووي) التقاط metabolome بأكمله في تحليل واحد. تطوير مثل هذه التقنيات (إعداد العينة، استخراج المستقلب والتحليل)، والتي توفر تغطية كبيرة من metabolome ممكن في غضون تشغيل تحليلي واحد، هو هدف رئيسي للباحثين metabolomics. وقد جمعت التحليلات السابقة غير المستهدفة لحبوب القمح بين البيانات المستمدة من عمليات فصل لوني متعددة وأقطاب اكتساب و/أو أجهزة لزيادة تغطية الميتابولم. غير أن ذلك تطلب إعداد عينات واقتنائها بشكل منفصل لكل طريقة. فعلى سبيل المثال، أعد كل من Beleggia et al.2 عينة مشتقة لتحليل التحليل GC-MS للتحليلات القطبية بالإضافة إلى تحليل GC-MS للتحليلات غير القطبية. واستخدم “داس” وآخرونأساليب “GC- وLC-MS” لتحسين التغطية في تحليلاتهم؛ غير أن هذا النهج سيتطلب عموما ً إعداد عينات منفصلة على النحو المبين أعلاه فضلاً عن منصتين تحليليتين مستقلتين. التحليلات السابقة لحبوب القمح باستخدام GC-MS22،3،,4 و LC-MS3،,5منصات قد أسفرت عن 50 إلى 412 (55 محددة) ميزات لGC-MS، 409 لGC-MS مجتمعة وLC-MS وعدة آلاف لتحليل الدهون LC-MS5. من خلال الجمع بين ما لا يقل عن وضعين في تحليل واحد ، يمكن الحفاظ على تغطية metabolome الموسعة ، مما يزيد من ثراء التفسير البيولوجي مع توفير في الوقت والتكلفة على حد سواء.
للسماح بالانفصال الفعال لمجموعة واسعة من أنواع الدهون عن طريق اللوني عكس المرحلة، والمنهجيات الحديثة الدهون تستخدم عادة نسبة عالية من الإيزوبروبانول في المذيبات elution6،وتوفير وسائل الراحة لفئات الدهون التي قد تكون خلاف ذلك دون حل من قبل الكروماتوغرافيا. لفصل الدهون كفاءة، مرحلة متنقلة بدءا هو أيضا أعلى بكثير في التكوين العضوي7 من الأساليب الكروماتوغرافية المرحلة النموذجية عكس، والتي تنظر في فئات أخرى من الجزيئات. التركيب العضوي العالي في بداية التدرج يجعل هذه الأساليب أقل ملاءمة للعديد من الفئات الأخرى من الجزيئات. وعلى الأخص، يستخدم اللون اللوني السائل للمرحلة المعكوسة تدرجًا ثنائيًا مذيبًا ، بدءًا من تكوين مائي في الغالب وزيادة في المحتوى العضوي مع زيادة قوة اللونية. ولتحقيق هذه الغاية، سعينا إلى الجمع بين النهجين لتحقيق الفصل بين كل من الفئات الدهنية وغير الدهنية من الأيض ضمن تحليل واحد.
هنا، نقدم طريقة كروماتوغرافية تستخدم مرحلة متنقلة ثالثة وتمكن من مرحلة تقليدية معكوسة مشتركة وطريقة كروماتوغرافية مناسبة للدهون باستخدام إعداد عينة واحدة وعمود تحليلي واحد. لقد اعتمدنا العديد من تدابير مراقبة الجودة وخطوات تصفية البيانات التي تم تنفيذها سابقًا في دراسات metabolomics السريرية في الغالب. وهذه النُهج مفيدة في تحديد السمات القوية ذات الاستنساخ التقني العالي والأهمية البيولوجية وتستبعد تلك التي لا تستوفي هذه المعايير. على سبيل المثال، نحن نصف تكرار تحليل عينة مراقبة الجودة المجمعة8،QC التصحيح9،تصفية البيانات9،,10 ونسب الميزات المفقودة11.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، نقدم طريقة metabolomics غير المستهدفة المستندة إلى LC-MS لتحليل حبوب القمح. وتجمع هذه الطريقة بين أربعة أوضاع للاقتناء (المرحلة المعكوسة والمرحلة المعكوسة للدهون والتأيّن الموجب والسالب) في وضعين بإدخال مرحلة متنقلة ثالثة في تدرج المرحلة المعكوس. وأسفر النهج المشترك عن نحو 500 من السمات ذات ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن ينوهوا ببرنامج زمالة الزراعة والأغذية التابع لرئيس وزراء غرب أستراليا (وزارة الوظائف والسياحة والعلوم والابتكار، وحكومة غرب أستراليا) وزميل رئيس الوزراء، البروفيسور سيمون كوك (مركز الزراعة الرقمية، جامعة كورتين وجامعة مردوخ). تم دعم التجارب الميدانية وجمع عينات الحبوب من قبل حكومة برنامج الإتاوات للمناطق في غرب أستراليا. نحن نعترف غرانتلي ستاينر وروبير الفرنسية لمساهماتهم في التجارب الميدانية. يتم الاعتراف بالمنصات الحيوية الأسترالية الممولة من NCRIS لتمويل المعدات.
Materials
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
- Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
- Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
- Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
- Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
- Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
- Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
- Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
- Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
- Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).
