Síntesis de nanopartículas magnéticas funcionalizadas, su conjugación con el Siderophore Feroxamine y su Evaluación para la Detección de Bacterias
Summary
Este trabajo describe protocolos para la preparación de nanopartículas magnéticas, su recubrimiento con SiO2,seguido de su funcionalización de amina con (3-aminopropil)trietilsilano (APTES) y su conjugación con deferoxamina utilizando una moiedad sucinil como enlace. También se describe en detalle una descripción estructural profunda y un ensayo de bacterias de captura utilizando Y. enterocolitica para todas las nanopartículas intermedias y el conjugado final.
Abstract
En el presente trabajo, se describe la síntesis de nanopartículas magnéticas, su recubrimiento con SiO2,seguido de su funcionalización de aminas con (3-aminopropil)triexisilano (APTES) y su conjugación con deferoxamina, un sideroforo reconocido por Yersinia enterocolitica,utilizando una moieteidad sucinil como enlacedor.
Las nanopartículas magnéticas (MNP) de magnetita (Fe3O4) se prepararon mediante método solvotermal y se recubrieron con SiO2 (MNP@SiO2) mediante el proceso de Stéber seguido de la funcionalización con APTES (MNP@SiO2@NH2). Luego, la feroxamina se conjugaba con el MNP@SiO2@NH2 por acoplamiento de carbodímida para dar MNP@SiO2@NH2@Fa. La morfología y las propiedades del conjugado y los intermedios fueron examinadas por ocho métodos diferentes, incluyendo la difracción de rayos X en polvo (RDX), la espectroscopia infrarroja de transformación de Fourier (FT-IR), la espectroscopia de Raman, la espectroscopia de fotoelectrón de rayos X (XPS), la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y el mapeo de rayos X dispersivos de energía (EDX). Esta caracterización exhaustiva confirmó la formación del conjugado. Finalmente, con el fin de evaluar la capacidad y especificidad de las nanopartículas, se probaron en un ensayo de bacterias de captura utilizando Yersinia enterocolitica.
Introduction
Los métodos de detección de bacterias que utilizan MNP se basan en el reconocimiento molecular de anticuerpos, aptámeros, bioproteínas, carbohidratos conjugados con MNP por la bacteria patógena1. Teniendo en cuenta que los sideróforos son reconocidos por receptores específicos en la membrana externa de las bacterias, también podrían vincularse a MNP para aumentar su especificidad2. Los sideróforos son pequeñas moléculas orgánicas implicadas en la absorción De Fe3+ por bacterias3,,4. Todavía no se ha notificado la preparación de conjugados entre los sideróforos y MNP junto con su evaluación para la captura y aislamiento de bacterias.
Uno de los pasos cruciales en la síntesis de conjugados de nanopartículas magnéticas con moléculas pequeñas es la selección del tipo de enlace o interacción entre ellas para asegurar que la molécula pequeña esté unida a la superficie del MNP. Por esta razón, el procedimiento para preparar el conjugado entre nanopartículas magnéticas y feroxamina —el sideróforo reconocido por Yersinia enterocolitica—se centró en la generación de una superficie modificable del MNP para permitir vincularlo covalentemente al sideróforo por la química del carbodia. Con el fin de obtener una nanopartículas de magnetita uniforme (MNP) y para mejorar la nucleación y el control de tamaño, se llevó una reacción de solvolisis con alcohol bencílico en un bloque térmico sin sacudir5. A continuación, se generó un recubrimiento de sílice por el método St-ber para conferir protección y mejorar la estabilidad de la suspensión de nanopartículas en medios acuosos6. Teniendo en cuenta la estructura de la feroxamina, la introducción de grupos de aminas es necesaria para producir nanopartículas adecuadas (MNP@SiO2@NH2)que se conjugan con el sideroforo. Esto se logró mediante la condensación de (3-aminopropil)triexisilano (APTES) con los grupos de alcohol presentes en la superficie de las nanopartículas modificadas de sílice (MNP@SiO2) utilizando un método sol-gel7.
Paralelamente, el complejo de hierro de feroxamina(III) se preparó mediante la complejidad de la deferoxamina disponible comercialmente con acetil acetil de hierro en solución acuosa. N-succinilferoxamina, que lleva grupos sucintos que actuarán como enlaces, se obtuvo por la reacción de la feroxamina con anhídrido succínico.
La conjugación entre MNP@SiO2@NH2 y N-succinilferoxamina para dar MNP@SiO2@NHFase llevó a cabo a través de la química de carbodiimida utilizando como reactivos de acoplamiento benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate (BOP) y 1-hydroxybenzotriazol (HOBt) en un medio básico suave para activar el grupo de ácido terminal en N-succinylferoxamine8.
Una vez que los MNP se caracterizaron, evaluamos las capacidades de las nanopartículas magnéticas desnudas y funcionalizadas para capturar el tipo salvaje (WC-A) y un mutante de Y. enterocolitica carente de receptor de feroxamina FoxA (FoxA WC-A 12-8). Los MNP simples, los MNP funcionalizados y el MNP@SiO conjugado2@NHFase les permitió interactuar con cada cepa de Y. enterocolitica. Los agregados bacteria-conjugados fueron separados de la suspensión bacteriana por la aplicación de un campo magnético. Los agregados separados se enjuagaron dos veces con solución salina tamponada de fosfato (PBS), re-suspendido en PBS para preparar diluciones en serie y luego, fueron chapados para el conteo de colonias. Este protocolo demuestra cada paso de la síntesis de MNP@SiO2@NH@Fa, la caracterización estructural de todos los intermedios y el conjugado, y un ensayo de captura de bacterias como una manera fácil de evaluar la especificidad del conjugado en relación con los intermedios. 9
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe la síntesis de un conjugado entre nanopartículas magnéticas y la feroxamina siderofore mediante unión covalente. La síntesis de magnetita se llevó a cabo utilizando el protocolo reportado por Pinna et al.5 seguido de recubrimiento de sílice para proteger el núcleo magnético de la corrosión en sistemas acuosos, minimizar la agregación y proporcionar una superficie adecuada para la funcionalización6. Se modificó el proceso de recubrimiento…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al profesor Klaus Hantke (Universidad de Tubinga, Alemania) por suministrar amablemente las cepas Yersinia enterocolitica utilizadas en esta obra. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones AGL2015-63740-C2-1/2-R y RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, UE) de la Agencia Estatal de Investigación (AEI) de España, cofinanciada por el Programa FEDER de la Unión Europea. Los trabajos en la Universidad de Santiago de Compostela y la Universidad de A Coruña también contaron con el apoyo de las becas GRC2018/018, GRC2018/039 y ED431E 2018/03 (grupo estratégico CICA-INIBIC) de Xunta de Galicia. Por último, queremos agradecer a Nuria Calvo su gran colaboración haciendo la voz de este protocolo de vídeo.
Materials
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT |
Acros | 300561000 | |
| 2,2′-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane 99% | Acros | 151081000 | |
| Ammonium hydroxide solution 28% NH3 | Sigma Aldrich | 338818 | |
| Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent | Acros | 209800050 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 822259 | |
| Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) | Sigma Aldrich | D9533 | |
| Ethanol, anhydrous, 96% | Panreac | 131085 | |
| Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical | |||
| Iron(III) acetylacetonate 97% | Sigma Aldrich | F300 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022 | |
| N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal | Acros | 459591000 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 326871000 | |
| Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 339421000 | |
| Sephadex LH-20 | Sigma Aldrich | LH20100 | |
| Succinic anhydride >99% | Sigma Aldrich | 239690 | |
| Tetraethyl orthosolicate >99,0% | Sigma Aldrich | 86578 |
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