Синтез функциональных магнитных наночастиц, их спряжение с Siderophore Фероксамин и его оценка для обнаружения бактерий
Summary
Эта работа описывает протоколы для подготовки магнитных наночастиц, его покрытие с SiO2, а затем его аминь функционализации с (3-аминопропил) триэтоксисилана (APTES) и его спряжения с deferoxamine с помощью succinyl moiety в качестве связучателя. Глубокое описание структурной характеристики и анализ бактерий захвата с помощью Y. enterocolitica для всех промежуточных наночастиц и окончательный конъюгированный также описаны в деталях.
Abstract
В настоящей работе, синтез магнитных наночастиц, его покрытие с SiO2, а затем его аминь функционализации с (3-аминопропил) триетоксисилана (APTES) и его спряжение с deferoxamine, боковой дрофор признан Yersinia enterocolitica, используя succinyl moiety в качестве связувателя описаны.
Магнитные наночастицы (MNP) магнетита (Fe3O4) были подготовлены solvothermal методом и покрыты SiO2 (MNP@SiO2) с использованием процесса Стёбер следуют функционализации с APTES (MNP@SiO2@NH2). Затем, фероксамин был конъюгированных с MNP@SiO2@NH2 карбодиимид соединения дать MNP@SiO2@NH2@Fa. Морфология и свойства конъюгированных и промежуточных были изучены восемью различными методами, включая дифракцию порошкового рентгеновского излучения (XRD), фурье трансформировать инфракрасную спектроскопию (FT-IR), спектроскопию Романа, рентгеновскую фотоэлектронную спектроскопию (XPS), микроскопию электронов передачи (TEM) и энергетическую дисперсию X-Ray. Эта исчерпывающая характеристика подтвердила формирование конъюгата. Наконец, для того, чтобы оценить емкость и специфичность наночастиц, они были протестированы в захвате бактерий анализа с помощью Yersinia enterocolitica.
Introduction
Методы обнаружения бактерий с использованием MNP основаны на молекулярном распознавании антител, апгтемеров, биопротеинов, углеводов, спряженных к MNP патогенными бактериями1. Принимая во внимание, что siderophores признаются конкретных рецепторов на внешней мембране бактерий, они также могут быть связаны с MNP, чтобы увеличить их специфичность2. Siderophores являются небольшие органические молекулы, участвующие в Fe3 “поглощение бактериями3,4. О подготовке спряжений между бокофорами и МНП наряду с их оценкой для улавливания и изоляции бактерий пока не сообщалось.
Одним из важнейших шагов в синтезе конъюгированных магнитных наночастиц с небольшими молекулами является выбор типа связи или взаимодействия между ними для обеспечения того, чтобы небольшая молекула была прикреплена к поверхности MNP. По этой причине, процедура подготовки конъюгировать между магнитными наночастицами и фероксамином- siderophore признанных Yersinia enterocolitica-была сосредоточена на генерации модифицируемой поверхности MNP, чтобы увязать его ковалентно в siderophore карбодиимицидной химии. Для того, чтобы получить единый наночастицы магнетита (MNP) и улучшить нуклеацию и контроль размера, реакция solvolysis с бензиловым спиртом была проведена в тепловом блоке без встряхивания5. Затем кремнеземное покрытие было сгенерировано методом Стёбера для защиты и повышения устойчивости подвески наночастиц в aqueous media6. Принимая во внимание структуру фероксамина, введение аминь групп необходимо для производства подходящих наночастиц (MNP@SiO2@NH2),чтобы быть сопряжены с siderophore. Это было достигнуто путем конденсации (3-аминопропил) триетоксисилана (APTES) с алкогольными группами, присутствующими на поверхности кремнезема модифицированных наночастиц (MNP@SiO2) с использованием метода соль-геля7.
Параллельно комплекс фероксаминов железа (III) был подготовлен комплексом коммерческого дефероксамина с ацетонатом железа ацетилата в аквеевом растворе. N-succinylferoxamine, подшипник succinyl групп, которые будут выступать в качестве связунов, был получен реакцией фероксамина с сукциническим ангидридом.
Спюгация между MNP@SiO2@NH2 и N-succinylferoxamine дать MNP@SiO2@NHиФа была проведена через карбодииимид химии с использованием в качестве соединения реагентов бензорифотризол-1-й дифологтиуфос -оксофторофос (BOP) и 1-гидроксибензотриазол (HOBt) в мягком базовом носителе для активации терминальной кислотной группы в N-succinylferoxamine8. N
После того, как MNPs были охарактеризованы, мы оценили возможности голых и функциональных магнитных наночастиц для захвата дикого типа (WC-A) и мутант Y. enterocolitica не хватает фероксамина рецептора FoxA (FoxA WC-A 12-8). Равнины MNPs, функционализуемые MNPs и конъюгированных MNP@SiO2@NHФабыло разрешено взаимодействовать с каждым Y. enterocolitica штамма. Бактерии-конъюгированные агрегаты были отделены от бактерий подвески путем применения магнитного поля. Разделенные агрегаты дважды промывались фосфатным буферизированным физраствором (PBS), повторно приостанавливались в PBS для подготовки серийных разбавлений, а затем, они были покрыны для подсчета колоний. Этот протокол демонстрирует каждый шаг синтеза MNP@SiO2@NH@Fa, структурную характеристику всех промежуточных и конъюгированных, а также анализ захвата бактерии как простой способ оценить специфику спряжения по отношению к промежуточным. 9 9
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает синтез спряжения между магнитными наночастицами и бокофором фероксамином путем ковалентной связи. Синтез магнетита был проведен с использованием протокола, о которого сообщает Pinna et al.5 с последующим кремнеземным покрытием для защиты магнитного я?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы с благодарностью признают профессора Клауса Хантке (Университет Тюбингена, Германия) за любезное снабжение штаммов Yersinia enterocolitica, используемых в этой работе. Эта работа была поддержана грантами AGL2015-63740-C2-1/2-R и RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, EU) от Государственного агентства по исследованиям (AEI) Испании, финансируемого программой FEDER от Европейского союза. Работа в Университете Сантьяго-де-Компостела и Университете А Корунья также была поддержана грантами GRC2018/018, GRC2018/039 и ED431E 2018/03 (стратегическая группа CICA-INIBIC) от Сюй-де-Галиции. Наконец, мы хотим поблагодарить Нурия Кальво за ее большое сотрудничество делать голос-офф этого видео-протокола.
Materials
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT |
Acros | 300561000 | |
| 2,2′-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane 99% | Acros | 151081000 | |
| Ammonium hydroxide solution 28% NH3 | Sigma Aldrich | 338818 | |
| Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent | Acros | 209800050 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 822259 | |
| Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) | Sigma Aldrich | D9533 | |
| Ethanol, anhydrous, 96% | Panreac | 131085 | |
| Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical | |||
| Iron(III) acetylacetonate 97% | Sigma Aldrich | F300 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022 | |
| N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal | Acros | 459591000 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 326871000 | |
| Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 339421000 | |
| Sephadex LH-20 | Sigma Aldrich | LH20100 | |
| Succinic anhydride >99% | Sigma Aldrich | 239690 | |
| Tetraethyl orthosolicate >99,0% | Sigma Aldrich | 86578 |
References
- Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2912-2942 (2012).
- Zheng, T., Nolan, E. M. Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens. Metallomics. 4, 866-880 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Sandy, M., Butler, A. Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores. Chemical Reviews. 109 (10), 4580-4595 (2010).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization. Chemistry of Materials. 17 (15), 3044-3049 (2005).
- Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles. Spectrochimica Acta – Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76 (5), 484-489 (2010).
- Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle. International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).
- El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation. Journal of the American Chemical Society. 129 (44), 13392-13393 (2007).
- Martínez-Matamoros, D., et al. Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection. RSC Advances. 9 (24), 13533-13542 (2019).
- Cozar, O., et al. Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B. Journal of Molecular Structure. 788 (1-3), 1-6 (2006).
- Shebanova, O. N., Lazor, P. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Journal of Solid State Chemistry. 174 (4), 424-430 (2003).
- González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses. Journal of Non-Crystalline Solids. 320 (12), 92-99 (2003).
- Veres, M., et al. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Diamond and Related Materials. 14 (3-7), 1051-1056 (2005).
- You, Y., et al. Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate. Applied Physics Letters. 93 (10), 103111-103113 (2008).
- Graf, N., et al. XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces. Surface Science. 603 (18), 2849-2860 (2009).
- Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level. Applied Surface Science. 137 (1-4), 179-183 (2002).
- Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).
- Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency. RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).
- Zhan, S., et al. Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles. Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).
