機能化された磁気ナノ粒子の合成、その結合とゼリロフォア・フェロキサミンの評価
Summary
この研究は、磁気ナノ粒子の調製のためのプロトコル、SiO2でのコーティング、続いて(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)とのアミン官能化と、コクニル部分をリンカーとして使用したデフェキサミンとの結合を説明する。すべての中間ナノ粒子と最終コンジュゲートに対してY.エンゴコリティカを用いた深い構造特性評価の説明および捕獲細菌アッセイも詳細に説明する。
Abstract
本研究では、磁気ナノ粒子の合成、SiO2によるそのコーティング、2続いて(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)とのアミン官能化と、エルシニアエンゴコリチカによって認識される副腎泳動であるデフェオキシアミンとの共役が、コルチニル部分をリンカーとして用いた。
マグネタイト(Fe3O4)の磁性ナノ3粒子(MNP)をソルボ熱法で調製し、ステーバー法を用いてSiO2(MNP@SiO2)で被覆し、続いてAPTESとの官能化を行い、その後にAPTES(MNP@SiO2@NH2)を用いた。2 222次いで、フェロキサミンをカルボジイミドカップリングによりMNP@SiO2@NH2と共役し、MNP@SiO2@NH2@Faを与えた。222コンジュゲートおよび中間体の形態と特性は、粉末X線回折(XRD)、フーリエ変換赤外分光法(FT-IR)、ラマン分光法、X線光電子分光(XPS)、透過電子顕微鏡(TEM)、エネルギー分散X線(EDX)マッピングを含む8つの異なる方法で調べた。この徹底的な特徴付けにより、コンジュゲートの形成が確認された。最後に、ナノ粒子の容量と特異性を評価するために、それらは、エルシニアエンテオコリチカを用いた捕獲細菌アッセイで試験した。
Introduction
MNPを用いた細菌検出方法は、抗体の分子認識に基づく、アプタマー、バイオプロテイン、病原性細菌1によってMNPに結合した炭水化物。シレブロフォアは細菌の外膜上の特定の受容体によって認識されることを考慮に入れて、彼らはまた、それらの特異性を増加させるためにMNPにリンクすることができます2.シドロフォアは、細菌3、44によるFe3+取り込み3に関与する小さな有機分子である。サイドロフォアとMNPの間のコンジュゲートの調製と、細菌の捕獲および単離に対する評価はまだ報告されていない。
小分子を用いた磁性ナノ粒子のコンジュゲート合成における重要なステップの1つは、MNPの表面に小分子が結合していることを確認するために結合の種類または相互作用の選択である。このため、磁気ナノ粒子とフェロキサミン(エルシニア・エンゴコリチカが認識するシドロフォア)とのコンジュゲートを調製する手順は、MNPの変更可能な表面の生成に焦点を当て、カルボジイミド化学によってシデロフォアに共有結合することを可能にした。均一なマグネタイトナノ粒子(MNP)を得るために、核形成及びサイズ制御を改善するために、ベンジルアルコールとのソルボ分解反応を、振盪せずに熱ブロック中に運んだ。次いで、水性媒体6におけるナノ粒子懸濁液の保護と安定性を向上させるステーバー法によりシリカコーティングを生成した。フェロキサミンの構造を考慮して、シデロフォアと共役する適切なナノ粒子(MNP@SiO2@NH2)2を生成するためにアミン基の導入が必要である。2これは、ソルゲル法7を用いてシリカ改変ナノ粒子(MNP@SiO2)の表面に存在するアルコール基を用いて(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(apTES)の凝縮によって達成された。
並行して、フェロキサミン鉄(III)錯体は、水溶液中のアセチルアセトネートの鉄と市販のデフェオキサミンを複合化することによって調製した。N-スクシニルフェロキサミンは、リンカーとして作用するスクシニル基を持ち、コハク酸無水とフェロキサミンの反応により得られた。
MNP@SiO2@NH22とN-succinylferoxamineの間の結合は、MNP@SiO2@NH@Fa@を与えるために、カップリング試薬ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス-()を使用してカルボジイミド化学を介して行った( ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロリン酸(BOP)及び1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)を軟質塩基性培地中でN-スクシニルフェロキサミン8中の末端酸基を活性化する。 N2
MPが特徴付けられると、野生型(WC-A)およびフェロキサミン受容体FoxAを欠くY.エンテオコリチカ(FoxA WC-A 12-8)の変異体を捕捉する、裸で機能的な磁気ナノ粒子の能力を評価した。プレーンMP、機能化されたMPおよび共役MNP@SiO2@NH@Faは、各@Y.エンゴコリチカ株と相互作用することを許可した。バクテリア共役凝集体を、磁場の印加により細菌懸濁液から分離した。分離した凝集体をリン酸緩衝生理食塩液(PBS)で2回リンスし、PBSで再懸濁して連続希釈を調製し、次いでコロニー計数用にメッキした。このプロトコルは、MNP@SiO2@NH@Faの合成の各ステップ、全ての中間体および共役体の構造的特徴付け、および中間体に関するコンジュゲートの特異性を評価する容易な方法として細菌捕獲アッセイを示す。9
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、共有結合による磁性ナノ粒子とシドロフォアフェロキサミンとのコンジュゲートの合成を記述する。マグネタイトの合成は、水系における腐食の磁気コアを保護するためにシリカコーティングを続けて、ピナら5によって報告されたプロトコルを用いて行い、凝集を最小限にし、機能化に適した表面を提供する6。シリカコーティング工?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、クラウス・ハントケ教授(ドイツ・テュービンゲン大学)が、この研究で使用されたエルシニア・エンテオコリティカ株を親切に供給してくれたことを感謝する。この研究は、欧州連合(EU)のFEDERプログラムが共同出資するスペインの国家研究機関(AEI/FEDER)からのAGL2015-63740-C2-1/2-RおよびRTI2018-093634-B-C22(AEI/FEDER、EU)からの助成金によって支えられました。サンティアゴ・デ・コンポステーラ大学とア・コルーニャ大学での研究も、GC2018/018、GRC2018/039、およびED431E 2018/03(CICA-INIBIC戦略グループ)の助成金によって支えられ、Xunta de Galiciaから。最後に、このビデオプロトコルのボイスオフを行う彼女の素晴らしいコラボレーションのためにヌリアカルボに感謝したいと思います。
Materials
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT |
Acros | 300561000 | |
| 2,2′-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane 99% | Acros | 151081000 | |
| Ammonium hydroxide solution 28% NH3 | Sigma Aldrich | 338818 | |
| Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent | Acros | 209800050 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 822259 | |
| Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) | Sigma Aldrich | D9533 | |
| Ethanol, anhydrous, 96% | Panreac | 131085 | |
| Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical | |||
| Iron(III) acetylacetonate 97% | Sigma Aldrich | F300 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022 | |
| N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal | Acros | 459591000 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 326871000 | |
| Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 339421000 | |
| Sephadex LH-20 | Sigma Aldrich | LH20100 | |
| Succinic anhydride >99% | Sigma Aldrich | 239690 | |
| Tetraethyl orthosolicate >99,0% | Sigma Aldrich | 86578 |
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