Synthèse des nanoparticules magnétiques fonctionnalisées, leur conjugaison avec la feroxamine de Siderophore et son évaluation pour la détection des bactéries
Summary
Ce travail décrit des protocoles pour la préparation des nanoparticules magnétiques, son revêtement avec SiO2, suivi de sa fonctionnalisation d’amine avec (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) et sa conjugaison avec la dferoxamine utilisant une moiety succinyl comme lieneur. Une description structurelle profonde de caractérisation et un test de bactéries de capture utilisant Y. enteropolitica pour toutes les nanoparticules intermédiaires et le conjugué final sont également décrits en détail.
Abstract
Dans le présent travail, la synthèse des nanoparticules magnétiques, son revêtement avec SiO2, suivi de sa fonctionnalisation amine avec (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) et sa conjugaison avec la dferoxamine, un siderophore reconnu par Yersinia enterocolitica, en utilisant un succinyl moiety comme un linker sont décrits.
Les nanoparticules magnétiques (MNP) de la magnétite (Fe3O4) ont été préparées par méthode solcothermale et enduites de SiO2 (MNP@SiO2) à l’aide du procédé Stöber suivi d’une fonctionnalisation avec APTES (MNP@SiO2@NH2). Puis, la feroxamine a été conjuguée avec le MNP@SiO2@NH2 par couplage carbodiimide pour donner MNP@SiO2@NH2@Fa. La morphologie et les propriétés du conjugué et des intermédiaires ont été examinées par huit méthodes différentes, y compris la diffraction des rayons X (XRD), la spectroscopie infrarouge à transformation Fourier (FT-IR), la spectroscopie Raman, la spectroscopie photoélectron à rayons X (XPS), la microscopie électronique de transmission (TEM) et la cartographie des rayons X dispersifs d’énergie (EDX). Cette caractérisation exhaustive a confirmé la formation du conjugué. Enfin, afin d’évaluer la capacité et la spécificité des nanoparticules, ils ont été testés dans un test de capture de bactéries à l’aide de Yersinia enterocolitica.
Introduction
Les méthodes de détection des bactéries utilisant MNP sont basées sur la reconnaissance moléculaire des anticorps, des aptamères, de la bioprotéine, des hydrates de carbone conjugués au MNP par la bactérie pathogène1. Compte tenu du fait que les siderophores sont reconnus par des récepteurs spécifiques sur la membrane externe des bactéries, ils pourraient également être liés au MNP pour augmenter leur spécificité2. Les siderophores sont de petites molécules organiques impliquées dans l’absorption de Fe3+ par les bactéries3,4. La préparation des conjugués entre les siderophores et le MNP ainsi que leur évaluation pour la capture et l’isolement des bactéries n’a pas encore été rapportée.
L’une des étapes cruciales de la synthèse des conjugués de nanoparticules magnétiques avec de petites molécules est la sélection du type de lien ou d’interaction entre elles pour s’assurer que la petite molécule est attachée à la surface du MNP. Pour cette raison, la procédure de préparation du conjugué entre les nanoparticules magnétiques et la feroxamine — le siderophore reconnu par Yersinia enterocolitica— a été axée sur la génération d’une surface modifiable du MNP pour permettre de la relier covalent au siderophore par la chimie carbodiimide. Afin d’obtenir une nanoparticule de magnétite uniforme (MNP) et d’améliorer la nucléation et le contrôle de la taille, une réaction de solvolyse avec de l’alcool benzyle a été effectuée dans un bloc thermique sans secouer5. Ensuite, un revêtement de silice a été généré par la méthode Stöber pour conférer la protection et améliorer la stabilité de la suspension des nanoparticules dans les milieux aqueux6. Compte tenu de la structure de la feroxamine, l’introduction de groupes d’amines est nécessaire pour produire des nanoparticules appropriées (MNP@SiO2@NH2) à conjuguer avec le siderophore. Ceci a été réalisé par condensation de (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) avec les groupes d’alcool présents à la surface des nanoparticules modifiées de silice (MNP@SiO2) utilisant une méthode de sol-gel7.
En parallèle, le complexe de fer feroxamine(III) a été préparé par la complexation de la déféroxamine disponible dans le commerce avec l’acétonate d’acétonate d’acétyl de fer dans la solution aqueuse. N-succinylferoxamine, portant des groupes de succinyl qui agiront comme linkers, a été obtenu par la réaction de la feroxamine avec l’anhydride succinique.
La conjugaison entre MNP@SiO2@NH2 et N-succinylferoxamine pour donner MNP@SiO2@NH@Fa a été effectuée par la chimie carbodiimide en utilisant comme couplage réactifs benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate (BOP) et 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) dans un milieu de base doux pour activer le groupe acide terminal dans N-succinylferoxamine8.
Une fois que les MNP ont été caractérisés, nous avons évalué les capacités des nanoparticules magnétiques nues et fonctionnalisées pour capturer le type sauvage (WC-A) et un mutant de Y. enterocolitica manquant de récepteur de feroxamine FoxA (FoxA WC-A 12-8). Les députés ordinaires, les députés fonctionnalisés et les MNP@SiOconjugués 2@NH@Fa ont été autorisés à interagir avec chaque souche Y. enteropolitica. Les agrégats de bactéries conjuguées ont été séparés de la suspension bactérienne par l’application d’un champ magnétique. Les agrégats séparés ont été rincés deux fois avec du phosphate tamponné saline (PBS), re-suspendus dans PBS pour préparer des dilutions en série et puis, ils ont été plaqués pour le comptage des colonies. Ce protocole démontre chaque étape de la synthèse de MNP@SiO2@NH@Fa, la caractérisation structurelle de tous les intermédiaires et du conjugué, et un test de capture de bactérie comme un moyen facile d’évaluer la spécificité du conjugué par rapport aux intermédiaires. 9
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit la synthèse d’un conjugué entre les nanoparticules magnétiques et la feroxamine de siderophore par liaison covalente. La synthèse de la magnétite a été réalisée à l’aide du protocole rapporté par Pinna et coll.5 suivi d’un revêtement de silice pour protéger le noyau magnétique de la corrosion dans les systèmes aqueux, pour minimiser l’agrégation et pour fournir une surface appropriée pour la fonctionnalisation6. Le processus de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le professeur Klaus Hantke (Université de Tübingen, Allemagne) d’avoir gentiment fourni les souches d’enteropolitica de Yersinia utilisées dans ce travail. Ces travaux ont été soutenus par des subventions AGL2015-63740-C2-1/2-R et RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, UE) de l’Agence d’État pour la recherche (AEI) d’Espagne, cofinancé par le programme FEDER de l’Union européenne. Les travaux de l’Université de Saint-Jacques-de-Compostelle et de l’Université d’A Coruña ont également été soutenus par des subventions GRC2018/018, GRC2018/039 et ED431E 2018/03 (groupe stratégique CICA-INIBIC) de Xunta de Galicia. Enfin, nous tenons à remercier Nuria Calvo pour sa grande collaboration en faisant la voix-off de ce protocole vidéo.
Materials
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT |
Acros | 300561000 | |
| 2,2′-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane 99% | Acros | 151081000 | |
| Ammonium hydroxide solution 28% NH3 | Sigma Aldrich | 338818 | |
| Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent | Acros | 209800050 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 822259 | |
| Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) | Sigma Aldrich | D9533 | |
| Ethanol, anhydrous, 96% | Panreac | 131085 | |
| Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical | |||
| Iron(III) acetylacetonate 97% | Sigma Aldrich | F300 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022 | |
| N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal | Acros | 459591000 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 326871000 | |
| Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 339421000 | |
| Sephadex LH-20 | Sigma Aldrich | LH20100 | |
| Succinic anhydride >99% | Sigma Aldrich | 239690 | |
| Tetraethyl orthosolicate >99,0% | Sigma Aldrich | 86578 |
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