新しい天然物を発見するためのツールとしての質量分析誘導ゲノムマイニング

二次代謝の調査は、多くの場合、特定の生物学的活性のための粗抽出物をスクリーニングし、その後、活性画分に属する成分の精製、同定、および特性化から構成される。このプロセスは、いくつかの化学実体の分離を促進し、効率的であることが証明されています。しかし、今日では、これは主に再発見率が高いため、実現不可能であると見なされています。医薬品産業は特殊代謝物の役割や機能を知らずに革命を起こしたので、その同定は、自然を正確に表さない実験室条件下で^行った。今日では、自然なシグナル伝達の影響、分泌、および検出不可能な低濃度でのほとんどの標的の存在をよりよく理解しています。さらに、プロセスの規制は、学術界や製薬業界がこの知識を活用するのに役立ちます。また、サイレント生合成遺伝子クラスター(BGC)2に関連する代謝産物の直接分離を含む研究にも利益²をもたらす。

この文脈において、ゲノムシーケンシングの進歩は、微生物代謝産物のスクリーニングへの関心を再び高めている。これは、発見された生合成クラスターのゲノム情報を分析することで、実験室の条件下で観察または生産されていない新しい化合物をコードする遺伝子を明らかにすることができるからです。現在、多くの微生物全ゲノムプロジェクトまたはドラフトが利用可能であり、その数は毎年増加しており、ゲノムマイニング^33、44を通じて新しい生理活性分子を発見するための大きな見通しを提供しています。

生合成遺伝子クラスターのアトラスは、共同ゲノム研究所(JGI IMG-ABC)2の統合微生物ゲノムプラットフォームの構成要素として自動的に採掘された遺伝子クラスターの現在最大のコレクションである。²最近では、生合成遺伝子クラスター(MIBiG)標準化イニシアチブの最小情報は、高度にキュレーションされた参照データセット⁵を提供し、Bgcsの手動リアノテーションを促進しました。今日では、遺伝データの計算マイニングと既知の二次代謝産物との接続を可能にする多くのツールが利用可能です。新しい生理活性天然産物(異種発現、標的遺伝子欠失、体外再構成、ゲノム配列、同位体誘導スクリーニング[ジェノミソトピックアプローチ]、局所および世界の規制当局の操作、抵抗標的ベースの採掘、文化独立採掘、さらに最近ではMSガイド/コードアプローチ^{,2、6、76,728、99、9 、MS}誘導/コードアプローチ)にアクセスするためのさまざまな戦略も開発されています。^10、11 、^{12、13、14、,15})。¹⁴

ゲノムマイニングは、単一の、または小さな分子グループにアナンスする努力を必要とします。したがって、分離と構造解明のために新しい化合物が優先されるプロセスのギャップが残っています。原則として、これらのアプローチは実験ごとに1つの生合成経路のみを対象とし、それによって発見速度が遅くなります。この意味で、GMを分子ネットワークアプローチと共に使用することは、天然物研究^14,15,にとって重要な進歩を表^している。

液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)の汎用性、精度、高感度により、化合物同定に適した方法です。現在、いくつかのプラットフォームは、対象のないメタボロ^,ミクス^{16、17、18、19、20,17}のためのアルゴリズムとソフトウェアスイート^19を20投資しています。^,18これらのプログラムの中核は、サンプルのバッチ間で同一の特徴の一致を可能にし、パターンを検索する機能検出(ピークピッキング⁾²¹とピークアライメントを含む。MSパターンベースのアルゴリズム^22,23は特徴的な断片化パターンを比較し^、23構造特徴を共有する分子ファミリーを生成するMS²類似点と一致する。これらの特徴は、次に、同時にMS^2、24、25によって複雑な生物学的抽出物から既知および未知の分子を迅速に発見²する能力を与え、強調表示^25され、クラスタ化することができる。^,したがって、タンデムMSは、大量のデータに含まれる複数の化学式の構造情報を同時に得る汎用性の高い方法である。

グローバル天然物社会分子ネットワーキング^(GNPS)26アルゴリズムは、正規化されたフラグメントイオン強度を使用して多次元ベクトルを構築し、コサイン関数を用いて類似点を比較する。異なる親イオンの関係は図表表現にプロットされ、各フラグメント化は節点(円)として視覚化され、各節点の関連はエッジ(線)によって定義されます。単一のソースからの分子のグローバルな可視化は、分子ネットワークとして定義されます。一意に断片化する構造的に発散する分子は、独自の特定のクラスターまたは星座を形成し、関連する分子は一緒にクラスターします。化学型のクラスタリングは、類似した構造特徴を生合成起源と仮定的に結び付けることを可能にする。

化学型から遺伝子型へのアプローチと遺伝子型から化学型へのアプローチの両方を組み合わせることは、Bgcsとその小分子製品²⁷との間のバイオインフォマティクスリンクを作成する際に強力である。したがって、MS誘導ゲノムマイニングは、迅速な方法であり、低材料消費戦略であり、多様な代謝および環境条件下で1つ以上の株のWGSによって明らかにされた親イオンおよび生合成経路を橋渡しするのに役立ちます。

このプロトコルのワークフロー ( 図1) は、WGS データを、ANTISMASH²⁸、^29,、30などの生合成遺伝子クラスタアノテーション プラットフォームに供給する方法で構成されています。これは、ゲノムによってコードされる化合物の多様性および化合物のクラスを推定するのに役立ちます。目的とする化学主体をコードする生合成遺伝子クラスターを標的とする戦略を採用する必要があり、BGCを含む野生型株および/または異種株からの培養抽出物を分析して^{、GNPS 26,3131}を用いて類似性に²⁶基づいてクラスターイオンを生成することができる。したがって、標的となるBGCに関連し、データベースでは使用できない新しい分子を同定することが可能です(主に未知の類似体、時には低い価数で生成される)。ユーザーがこれらのプラットフォームに貢献し、バイオインフォマティクスとMS/MSデータの可用性が急速に増加しており、複雑な抽出物と分子との効率的な接続を導くために効果的な計算ツールとアルゴリズムの絶え間ない開発とアップグレードに追い込まれていることを考慮することが重要です。

図 1: ワークフロー全体の概要図は、新しい代謝産物を同定するための、記載されたMSガイド型ゲノムマイニング手法に関与するバイオインフォマティクス、クローニング、および分子ネットワーキングのステップを示しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

このプロトコルは、ゲノムマイニングと分子ネットワーキングを自然製品発見パイプラインの出発点として組み合わせるための迅速かつ効率的なワークフローを記述します。多くのアプリケーションは、1つのネットワーク内のMS検出可能な分子の組成と関連を可視化することができますが、構造的に類似したクラスター化された分子を視覚化するために、ここでいくつかが採用されています。この戦略を用いて、ストレプトマイセスsp.CBMAI 2042の代謝抽出物で観察された新規のシクロデプシペプチド産物が正常に同定される。ゲノムマイニングによって導かれ、バリノマイシンをコードする全生合成遺伝子クラスターが認識され、生産者株ストレプトマイセス・コエカラー M1146にクローン化される。最後に、MSパターンベースの分子ネットワーキングに続いて、MSによって検出された分子は、その生物発生を担う^BGC32と相関している。