Postnatal (P1−3) Fare Nörojenik Nişlerden Nörosferlerin İzolasyon ve Genişlemesi

Tüm deneyler, bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunması için Avrupa Topluluğu (86/609/EEC; 2010/63/EU; 2012/707/EU) ve Portekizce (DL 113/2013) mevzuatına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokol “iMM kurumsal Hayvan Refahı Kurumu – ORBEA-iMM ve Ulusal yetkili otorite – DGAV (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária) tarafından onaylandı.” 1. Kültür ortamının temel kurulumu ve hazırlanması Diseksiyon gününde, Dulbecco’nun modifiye kartal ortamı [(DMEM)/L-glutaminli F12](Malzeme Tablosu)ile 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin (kalem/strep), %1 B27’den oluşan serumsuz ortama (SFM) karşılık gelen uygun miktarda büyüme ortamı nı hazırlayın, ayrıca 10 ng/mL EGF ve 5 ng/mL bFGF ile. Bir su banyosunda kültür ortamını 37 °C’ye ısıtın.NOT: Büyüme ortamının hacmi yavru sayısına bağlıdır, çünkü 5 yavru ~100 mL (SVZ için 50 mL ve DG için 50 mL); ancak, hücre sayısını (adım 5.1) sayıldıktan sonra tam hacmin ayarlanması gerekir. SVZ ve DG mikrodiseksiyoniçin, kalsiyum ve magnezyumsuz Hanks’in dengeli tuzlu solüsyonu (HBSS) diseksiyon ortamını 100 U/mL kalem/strep ile destekleyin.NOT: 50−100 mL diseksiyon ortamı hazırlayın. Bir diseksiyon mikroskobu ayarlayın ve beyin kaldırmak için gerekli araçları hazırlamak (makas ve küçük spatula) ve SVZ ve DG mikrodiskes (Dumont küçük makas, #7 forseps, #5 forseps, #5S forseps) için% 70 etanol ıslatma tarafından. 2. Postnatal (P1−3) fare beyinlerinin ve SVZ/DG mikrodiskeslerinin hasat 60 mm Petri tabakları (büyüme alanı 21 cm2)kalem/strep ve 2 numune tüpü (biri SVZ ve diğeri DG için) ve her biri 500 μL’lık ilave HBSS ile desteklenmiş HBSS ile hazırlayın. Kurumsal Hayvan Bakım tesisi/yönergeleri tarafından onaylanan protokole göre fare yavrularına (P1−3) ötenazi yapmak. Beyin sapının tabanında keskin makas ile tek bir kesi ile decapitation gerçekleştirin. Başın tabanında vücudun ventral kısmını tutarak ve küçük sivri makas kullanarak, başın tüm uzunluğu boyunca deride bir orta hat kesi yapmak, böylece kafatası yüzeyini ortaya. Kafatasının tabanında uzunlamasına bir kesi yapın ve beyin yapılarına zarar vermemek için mümkün olduğunca sığ bir açıile küçük makas kullanarak sagittal sütür boyunca kesmeye devam edin. Kavisli forceps kullanarak yanlara kafatası soyma ve beyin ortaya çıkarmak.DİkKAT: Beyne dokunmadan önce diseksiyon aletlerinin etanolsüz olduğundan emin olun. Küçük bir spatula kullanarak kafatasından beyin izole, beynin tabanına bağlı kranial sinirler ve kan damarları kesmek için beynin tabanının altında kayarak, ve soğuk takviyeLI HBSS çözüm içeren bir Petri kabına beyin transferi. Düşük büyütme bir diseksiyon mikroskobu altında beyin içeren Petri çanak yerleştirin ve sırt yüzeyinde beyin konumlandırmak. Ince forceps kullanarak, beyincik tarafından pozisyonda beyin tutarken, beynin ventral tarafında menenjler ve koku ampuller kaldırın. Ventral yönü üzerine beyin döndürün ve menenjler geri kalanı soyma.NOT: Dorsal menenjlerin çıkarılması doğru beyin dilimleme sağlamak için çok önemli bir adımdır. Forceps kullanarak bir kesim yapma beyincik atın. Bir doku helikopteri(Malzeme Tablosu)üzerine 11 μm gözenek boyutunda bir filtre kağıdı yerleştirin ve kavisli sivri forceps kullanarak filtre kağıdı üzerine beyin ayarlayın. 450 μm koronal kesitler içine beyin doğrayın ve soğuk takviyeLI HBSS ile dolu yeni bir Petri çanak içine kesitli beyin toplamak için ıslak bir lamina kullanın. SVZ’yi incelemek için, koronal dilimleri anterior-posterior bir şekilde ayırmak için, diseksiyon mikroskobu altında lateral ventriküllerle dilimlere ulaşana kadar forseps kullanın. Striatal parankim ve korpus callosum hariç ince forseps ile ventriküllerin lateral duvarÇevreleyen doku ince tabaka kesin (SVZ karşılık gelir). Lateral ventrikül lateral köşelerinde forseps ucu yerleştirerek SVZ izole: bir hemen korpus callosum altında ve diğer doku içine hemen lateral ventrikül ventrikül ventral alana bitişik. Sonra, lateral ventrikül çevreleyen doku küçük bir çizgi kesti. Daha önce SVZ olarak tanımlanan ek HBSS çözeltisi ile bir örnek tüp içine parçalanmış doku toplamak.NOT: SVZ’yi hem lateral ventriküllerin hem de hipokampal formasyonun görünmeye başladığı dilimler halinde dışleyin. Bir ön-posterior moda SVZ mikrodiziseksiyon sonra tüm dilimleri geçmesi ve hipokampal oluşumuulaşmak. Forceps kullanarak DG hala tanınmaz hipokampus ile ilk dilim atın. DG kaldırmak için, ilk dilimlerden hipokampus izole. DG’nin etrafındaki sınırları görselleştirmek için mikroskobu yeniden odakla. DG ve CA1 bölgesi arasında bir kesik gerçekleştirerek DG kısmını inceleyin ve ardından forseps kullanarak DG ve CA3 bölgesi arasında dikey bir kesim. Fimbria ve herhangi bir komşu doku çıkarın.NOT: P1−3 hayvanlarda, DG Ammon boynuzneredeyse ayırt edilemez ama küçük bir ipucu görüntüler. Daha önce DG olarak tanımlanan ek HBSS çözümleri içeren bir örnek tüp içine parçalanmış doku toplamak.NOT: Hipokampus veya çevresinde genel yaralanma daha zor DG izole yapacaktır. Kullanıcı koronal kesitlerden SVZ ve DG dokusunun izolasyonu aşina olmadığında postnatal fare beyin bir atlas kullanarak esastır. 3. Doku dissociasyonu Kendi tüplerinde bulunan SVZ ve DG dokusunu ayırmak için, HBSS’de Tripsin-EDTA’nın %5−10’u kadar son konsantrasyona sahip olmak için tripsin-EDTA %0.05 ekleyin. Doku bir araya gelene kadar 37 °C’de yaklaşık 15 dakika kuluçkaya yatırın. Ortamı çıkararak ve 1 mL yeni HBSS takviyesi çözeltisi ekleyerek 4 kez tripsinden dokuyı yıkayın. HBSS’yi çıkarın ve 10 ng/mL EGF ve 5 ng/mL bFGF ile takviye edilmiş 1 mL SFM’de sindirilmiş dokuyu yeniden askıya alın. P1000 pipetkullanarak yaklaşık 7−10x’i hafifçe borulandırarak, homojen bir hücre çözeltisi elde edene kadar peleti mekanik olarak ayrıştırın.DİkKAT: Aşırı mekanik ayrışma hücre ölümünün artmasına yol açabilir ve sonraki hücre büyümesini olumsuz yönde etkileyebilir. 4. Hücre kaderini incelemek için hücre çifti teşbesi Deneyden önce, 8-10. Kaplanacak SVZ veya DG hücrelerinin sayısını (bölüm 3’te elde edilen) saymak için % 0,2 Trypan mavisi içeren bir çözelti kullanın ve hematositometre kullanarak hücreleri sayın. 5 ng/mL EGF ve 2.5 ng/mL bFGF (düşük EGF/bFGF) ile takviye edilen SFM’deki ayrıştırılmış hücre süspansiyonu 11.300 hücre/cm2 yoğunlukta seyreltin ve kaplamalı cam kapaklara yerleştirin. 24 saat sonra, cinsiyet belirleme bölgesi Y-box 2 (Sox2) ve nestin gibi NSC belirteçlerine karşı immünositokimya için hücreleri düzeltmek yanı sıra nöronal soy bir belirteç ile (yani doublecortin [DCX], olgunlaşmamış nöronlar için) (bölüm 14 bakınız).NOT: Sox2 mitoz geçiren NSC’lerin bir belirtecidir. Tek bir ata hücre bölünmesinden kaynaklanan Sox2+/+ hücre çiftleri kök hücregenişlemesiniyansıtır 7 . 5. Postnatal nöral kök hücrelerin nörosfer olarak genişlemesi Ayrıştırılmış SVZ veya DG hücre süspansiyonunun yoğunluğunu belirlemek için (bölüm 3’te elde edilen), hücreleri hematositometre kullanarak sayın. SFM’de 2 x 104 hücre/mL yoğunlukta seyreltilmiş SVZ ve DG tek hücreli süspansiyon 10 ng/mL EGF ve 5 ng/mL bFGF ile desteklenmiştir. Son hacmi 5 mL/Petri kabı olan 60 mm Petri kaplanmış tohum Luz ve DG hücreleri. SVZ ve DG hücrelerini sırasıyla 6−8 gün ve 10−12 gün boyunca inkübülye etmek için sırasıyla primer nörosferler oluşturmak için 37 °C’de %5 CO2.NOT: Bahsedilenlerden daha fazla kuluçka gün nörosferlerin toplanması ve nörosferin merkezinde hücre ölümü yüksek düzeyde teşvik edebilir. Nörosferlerin büyük bir kısmı 150−200 m çapa sahip olduğunda, nörosfer geçişini gerçekleştirin.NOT: Uygun bir çapa sahip olmadıklarında pas ören nörosferler sonraki tüm adımları tehlikeye atar. 6. Nörosferlerin geçişi NOT: SVZ ve DG nörosferlerinin genişletilmesi için aşağıdaki protokol uygulanabilir. Nörosferleri geçiş için, 60 mm Petri çanak (es) ve 300 x g5 dakika için santrifüj nörosferler içeren büyüme faktörleri ile SFM toplamak . Üreticinin talimatlarına göre bir kimyasal dissosiasyon kiti (fare) kullanarak supernatant atın ve nörosfer pelet resuspend(Malzeme Tablosu).NOT: Kuluçka sürelerini performans açısından çok önemli olduğu için tam olarak gözlemleyin. 300 x g5 dakika santrifüj , supernatant kaldırmak ve 10 ng / mL EGF ve 5 ng / mL bFGF ile desteklenen SFM 1 mL ekleyin. Nörosferleri ayrıştırmak için P1000 pipetiyle yaklaşık 10 x yukarı ve aşağı triturate. %0,2 Trypan mavisi ve hematositometre içeren bir çözelti kullanan hücre sayısını sayın. Kaplamasız 60 mm Petri kaplarında 2 x 104 hücre/mL yoğunlukta reseed hücreleri. SVZ ve DG hücrelerini sırasıyla %5 CO2ile 37 °C’de ikincil nörosferelde etmek için sırasıyla 6−8 gün ve 10−12 gün kuluçkaya yatırın.NOT: SVZ ve DG kaynaklı NSPC’lerin kendi kendini yenileme kapasitesine 5 ve 6 no’lu protokol bölümlerini izleyerek ulaşılabilir. Bunun için, 5 ng/mL EGF ve 2,5 ng/mL bFGF (düşük EGF/bFGF) içeren büyüme SFM ortamda 1.0 x 104 hücre/mL (kaplamasız 24 kuyu plakalı) yoğunlukta tohum SVZ ve DG hücreleri. Ortaya çıkan primer ve sekonder nörosfer sayısını sayın. 7. Nörosferlerin depolanması 60 mm Petri kaplarından nörosferleri (5.3 ve 6.7 adımlarından elde edilen) içeren ortamı toplayın. 300 x g 5 dakika santrifüj ve supernatant atın. Hücreleri 1 mL HBSS (300 x g’de5 dk) ile yıkayın. 300 x g5 dakika santrifüj, supernatant atın ve moleküler biyoloji analizi için -20 °C nörosferlerin pelet saklayın. 8. PDL kaplama plakası prosedürü Çözelti 1 (0,1 M borat tampon) hazırlamak için, tartMak 3.92 g borik asit ve seyreltmek 400 mL yüksek saflıkta su. PH’ı 8,2’ye ayarlayın ve yüksek saflıkta su yla 500 mL’ye kadar yapın. Çözelti hazırlamak için 2 (0.167 M borat tampon), tartmak 10.3 g borik asit ve seyreltmek 900 mL yüksek saflıkta su. PH’ı 8,2’ye ayarlayın ve yüksek saflıkta su yla 1000 mL’ye kadar yapın. Poli-D-lizin (PDL) (0,1 M borat tamponunda 1 mg/mL), 100 mL çözelti100 mL’de 100 mg PDL seyreltin. Hemen kullanmak veya -20 °C’de donup saklayın. Laminar akış altında, kuyu başına 1 coverslip ekleyin ve 15 dakika UV ışığı altında sterilize. Yeniden oluşturulmuş PDL’yi veya çözülmüş dondurulmuş PDL’yi kullanın. 100 μg/mL PDL’nin 0,167 M borat tamponunda 10 mL yeniden oluşturulmuş PDL’yi 90 mL çözeltiye ekleyerek nihai çözeltisini hazırlayın 2. Kuyulara en az 2 saat ila 37 °C’de son çözeltiyi ekleyin.NOT: 24 kuyulu plakalar için her kuyuya 500°L hacim ekleyin. Çözeltiyi çıkarın ve 3x yüksek saflıkta suyla yıkayın. Laminar akış kaputunda kapakları kurutun. Çok kuyulu kültür plakalarını 4 °C’de bırakın. 9. PDL/Laminin kaplama plakası prosedürü Birinci günde, 8. 2. günde, PDL çözeltisini çıkarın ve 3x yüksek saflıkta suyla yıkayın. Kurusun. Büyüme faktörlerinden yoksun soğuk SFM’de 5 μg/mL laminin hazırlayın. Kapaklara çözünmüş laminin ekleyin ve bir gecede 37 °C’de kuluçkaya yatırın.NOT: 24 kuyulu plakalar için her kuyuya 500°L hacim ekleyin. Pipet kullanarak laminini çıkarın.NOT: Kapakları lamininden yıkamayın. Hemen kullanın veya -20 °C’de saklayın. 10. Poli-L-ornitin (PLO) /laminin kaplama prosedürü Laminar akış altında, iyi başına bir coverslip ekleyin ve 15 dakika UV ışığı altında sterilize. Oda sıcaklığında 20 dakika (RT) için her kuyuya %0,01 FKÖ çözeltisi ekleyin.NOT: 24 kuyulu plakalar için her kuyuya 500°L hacim ekleyin. Çözeltiyi çıkarın ve sterilize edilmiş 1x PBS ile 3x yıkayın. Kurusun. Steril 1x PBS içinde 5 μg/mL laminin hazırlayın. 37 °C’de 2 saat kuluçka. Laminin’i çıkarın.NOT: Kapakları lamininden yıkamayın. Hemen kullanın.NOT: Coverslip’in bir pipet ucuyla kapak fişi hafifçe dokunarak FKÖ çözeltisi tarafından tamamen kaplandığından emin olun. Sarsıldığında, çok kuyulu plakalar ses vermemelidir. 11. Hücrenin farklılaşmış monotabakası oluşturarak neuritogenezin değerlendirilmesi RT’de 60 mm Petri kaplarından (bölüm 5’ten elde edilen) nörosferleri içeren g ortamları ve 5 dk 5 dakika santrifüj içeren ortamları toplayın. Supernatant atın ve ayrışma PBS 1 mL nörosferlerin pelet ayrıştırın (yani, Mg2+/Ca2+ ve EDTA’lı PBS [2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4 ve 0.5 mM EDTA 4Na, pH = 7.40]) 15 dk boyunca inkübe edilerek mekanik dissosiyasasyon. Alternatif olarak, bir kimyasal ayrışma kiti (fare)(Malzeme Tablosu)kullanarak nörosferleri ayrıştırın. RT’de 300 x g’da 5 dk santrifüj ve supernatant atın. Büyüme faktörlerinden yoksun 1 mL’lik sFM hücre peletini yeniden askıya alın. Hematositometre kullanarak hücre yoğunluğunu belirleyin. 3.766 hücre/cm2 ve 24 kuyulu plakalarda kaplanmış cam kapaklar üzerindeki plaka hücrelerinin yoğunluğunda büyüme faktörlerinden yoksun SFM’deki ayrıştırılmış hücre süspansiyonu seyreltin. 1−3 gün sonra, sitoiskeletin bir proteinine karşı immünositokimya için hücreleri sabitler (bkz. bölüm 14). 12. Nörosfer kültürlerinin farklılaşması NOT: Hücre genişlemesinden elde edilen nörosferler, primer veya geçitli nörosferlerden (bölüm 5 veya 6’da elde edilen) farklı nöral soylardan hücrelere ayrıştırılabilir. Nörosferlerin çapı 150−200 m olduğunda, 24 kuyulu plakalarda kaplanmış cam kapaklar üzerinde 25°L nörosfer süspansiyon orta ve plaka toplayın.NOT: Daha fazla nörosfer toplamak için, yavaşça merkezinde nörosferler konsantre Petri çanak döndürün. Sonra, merkezden pipet. Plakaları 37 °C’de 15 dakika boyunca bir kuvöze koyun, böylece nörosferler substrata yapışır. Daha sonra, büyüme faktörlerinden yoksun 500 μL SFM ekleyin (farklısal koşullar). 24 saat sonra, büyüme faktörlerinden yoksun taze SFM ile orta değiştirin. 37 °C’de %5 CO2 ve atmosferik hava ile farklı zaman noktaları (sırasıyla 2 ve 7 gün in vitro, DIV2 ve DIV7) için ayırt edin.NOT: Hücre sağkalım, çoğalma ve farklılaşma farklı hücre tahlilleri kullanılarak analiz edilebilir. 13. Hücre biyolojisi tahlilleri Hücre sağkalım tonu Kaplamalı nörosferleri 37 °C’de kuvözdeki hücre fiksasyonundan önce 30 dakika boyunca 3 μg/mL propidium iyodüre (PI) maruz bırakın.NOT: PI sadece bozulmuş membranbütünlüğü8 ile hücrelere girmek mümkün bir otofloresan ajandır. Hücre sağkalımını analiz etmek için caspase 3 boyama veya terminal deoksinükleotidyl transferaz dUTP nick-end etiketleme (TUNEL) analizi gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Hücre çoğalması tsay Kaplamalı nörosferleri 37 °C’de kuvözde fiksasyondan önce 4 saat boyunca 10 μM 5-bromo-2′-deoksiuridine (BrdU) maruz bırakın.NOT: BrdU, 9noluhücrelerde DNA sentezi sırasında dahil edilebilen sentetik bir timidin analogudur. Hücre farklılaşması tsası 7 günlük kaplama nörosferleri ilk 24 saat içinde 10 μM BrdU’ya, 37 °C’de kuvözde teşrin. Büyüme faktörlerinden yoksun SFM’yi (farklısal koşullar) yenileyin ve fiksasyona kadar 6 gün boyunca BrdU’nun yokluğunda hücrelerin gelişmesine izin verin.NOT: Bu nabız takip deneyleri, olgun nöral hücrelerin belirteçleri ile birlikte etiketleyerek, protokol sırasında olgun hücrelere farklılaşan ata hücrelerinin değerlendirilmesine olanak sağlar. 14. Nörosfer kültürlerinin immünboyamı Hücre fiksasyonu 1x PBS’de %4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın ve 4 °C veya -20 °C’de saklayın. Kuyulardan büyüme faktörlerinden yoksun SFM’yi çıkarın ve her kuyuya 4 °C’de 500°L 4 PfA ekleyin ve RT’de 20 dakika boyunca. 1x PBS ile 3x yıkayın, 5 dakika her zaman için, farklılaştırılmış nörosferler içeren kapakları. 4 °C’de 500 μL 1x PBS’de kullanıma kadar kapakları saklayın.NOT: Denemede BrdU yoksa, adım 14.3’e atlayın. Denatürasyon yöntemi (yalnızca BrdU deneyleri için) 37 °C’de 1 M HCl hazırlayın. 1x PBS’de 3x kapakları durular. PBS’de %1 noniyonik yüzey aktif madde içeren 30 dk için permeabilize hücreleri (örneğin, Triton X-100). 37 °C’de (~300 μL/well) 30−40 dk için 37 °C’ye kadar önceden ısıtılan 1 M HCl’lik denature dsDNA. 1x PBS ile kuyuları 4x yıkayın. Permeabilizasyon ve engelleme 5 dakika boyunca 1x PBS’de durula. 1x PBS ‘de (~300 μL/well) %0,5 nonik yüzey aktif madde ve %3 sığır serum albumini (BSA) ile 1,5 saat kuluçka.NOT: NeuN için 1x PBS’de %6 BSA kullanın. Kuluçka ve montaj 1. gün, yıkamadan, kuluçka odasında %0,1 nonik yüzey aktif maddede primer antikorlu(Malzeme Tablosu)ve 1x PBS’de %0,3 BSA içeren hücreleri kuluçkaya yatırın (24 kuyulu plakalar için 20 μL/iyi kullanın). Antikorlar bir florofora konjuge ise 4 °C ışık korumalı gecede kuluçka kapakları bırakın. 2. günde, kapakları kendi kuyularına geri dönün ve 1x PBS’de 5 dakika boyunca 3x durula. Uygun floresan konjuge sekonder antikorlar (seyreltme 1:200) ve 12 μg/mL Hoechst 33342 ile 1x PBS’de 2 saat RT ve inkübasyon odasında ışık korumalı (20 μL/coverslip) ile karşı lekesi. 5 dakika boyunca 1x PBS 3x kapakları yıkayın. Floresan montaj ortamının 5 μL/coverslip’ini kullanarak kapakları mikroskop slaytlarına monte edin. Rt’de kapaklar havayı kurutun, ışıktan korunsun, 1 gün boyunca. Mikroskopi Floresan mikroskobu kullanarak görüntüleri görüntüleyin ve edinin. Her koşul için üç çoğaltma kullanın. Her coverslip’te 40x hedefiyle (alan başına~100 hücre) beş bağımsız mikroskobik alanda hücre sayımlarını gerçekleştirin. 15. EGF ve bFGF stok çözümlerinin hazırlanması EGF stok çözümü Liyofilize egf’yi yeniden oluşturmak için ürünü yüksek saflıkta seyreltin ve 20 g/mL’lik son konsantrasyona ulaşın. Aliquot ve mikrotüplerde -5 ila -20 °C’de saklayın. bFGF stok çözümüNOT: bFGF 10 mM Tris, pH 7.6 çözeltisi ile yeniden oluşturulmalıdır. İçeriği en alta getirmek için açmadan önce şişeyi kısa bir süre santrifüj edin. 10 mM Tris 50 mL, pH 7.6 hazırlayın. Bunun için 60,57 mg Tris ((HOCH2)3CNH2) ağırlığında ve 40 mL yüksek saflıkta su ile seyreltin. PH’ı 7,6’ya ayarlayın ve yüksek saflıkta su yla 50 mL’ye kadar yapın. 10 mM Tris’te 10 mL %0.1 BSA, pH 7.6 hazırlayın. Bunun için 10 mg BSA ağırlığında ve 10 mM Tris 10 mL seyreltin. 15.2.2 ve 15.2.3 adımlarında laminar akış kaputunun altında 0,22 m filtre ile hazırlanan filtre çözümleri. 10 μg bFGF’yi 10 μG/mL’lik son konsantrasyona ulaşmak için 10 mM Tris’te %0,1 BSA’da pH 7,6 ile yeniden oluşturun. Aliquot mikrotüpler içine -20 °C en fazla 6 ay.