Aislamiento y expansión de las neuroesferas de los nichos neurogénicos de ratón (P1-3)

Todos los experimentos se realizaron de conformidad con la legislación de la Comunidad Europea (86/609/CEE; 2010/63/UE; 2012/707/UE) y portuguesa (DL 113/2013) para la protección de los animales utilizados con fines científicos. El protocolo fue aprobado por el “Organismo Institucional de Bienestar Animal – ORBEA-iMM y la autoridad nacional competente – DGAV (Direc-o Geral de Alimentao e Veterinária).” 1. Configuración básica y preparación del medio de cultivo El día de la disección, preparar la cantidad adecuada de medio de crecimiento correspondiente al medio libre de suero (SFM) compuesto por el medio águila modificado de Dulbecco [(DMEM)/F12 con L-glutamina](Tabla de Materiales)complementado con 100 U/ml de penicilina y 100 g/mL de estreptomicina (lápiz/estreptococo), 1% B27, con también 10 ng/mL EGF y 5 ng/mL bFGF. Calentar el medio de cultivo a 37 oC en un baño de agua.NOTA: El volumen del medio de crecimiento depende del número de cachorros, para 5 cachorros preparan 100 ml (50 ml para SVZ y 50 ml para DG); sin embargo, después de contar el número de celdas (paso 5.1) el volumen exacto tendrá que ser ajustado. Para la microdisección de SVZ y DG, prepare el medio de disección solución salina equilibrada (HBSS) libre de calcio y magnesio complementado con 100 U/ml de pluma/estreptococo.NOTA: Prepare 50 a 100 ml de medio de disección. Configure un microscopio de disección y prepare las herramientas necesarias para eliminar el cerebro (tijeras y espátulas pequeñas) y para microdisecciones SVZ y DG (tijeras pequeñas dumont, #7 fórceps, #5 fórceps, #5S fórceps) empapadando en 70% de etanol. 2. Cosecha de cerebros de ratón postnatal (P1-3) y microdisecciones SVZ/DG Preparar platos Petri de 60 mm (área de crecimiento 21 cm2) con HBSS complementado con bolígrafo/estreptococo y 2 tubos de muestra (uno para SVZ y otro para DG) con 500 ml de HBSS suplementado cada uno. Euthanizar cachorros de ratones (P1-3) de acuerdo con el protocolo aprobado por las instalaciones/directrices de cuidado de animales institucionales. Realizar la decapitación con una sola incisión con tijeras afiladas en la base del tronco encefálico. Sosteniendo la parte ventral del cuerpo en la base de la cabeza y usando pequeñas tijeras puntiagudas, hacer una incisión de línea media en la piel a lo largo de toda la longitud de la cabeza, revelando así la superficie del cráneo. Hacer una incisión longitudinal en la base del cráneo y continuar cortando a lo largo de la sutura sagital utilizando pequeñas tijeras con un ángulo poco profundo como sea posible con el fin de evitar dañar las estructuras cerebrales. Pelar el cráneo a los lados usando fórceps curvos y exponer el cerebro.ADVERTENCIA: Asegúrese de que los instrumentos de diseción estén libres de etanol antes de tocar el cerebro. Aislar el cerebro del cráneo usando una pequeña espátula, deslizándose debajo de la base del cerebro para cortar los nervios craneales y los vasos sanguíneos que están conectados a la base del cerebro, y transferir el cerebro en una placa Petri que contiene solución de HBSS suplementada en frío. Coloque la placa Petri que contiene el cerebro bajo un microscopio de disección con bajo aumento y coloque el cerebro en su superficie dorsal. Usando fórceps finos, retire las meninges del lado ventral del cerebro y las bombillas olfativas, mientras mantiene el cerebro en posición por el cerebelo. Gire el cerebro sobre el aspecto ventral y despegue el resto de las meninges.NOTA: La eliminación de las meninges dorsales es un paso crucial para asegurar el corte correcto del cerebro. Deseche el cerebelo haciendo un corte usando fórceps. Coloque un papel de filtro con un tamaño de poro de 11 m en un helicóptero de tejido(Tabla de materiales)y coloque el cerebro en el papel de filtro usando fórceps de punta curva. Corta el cerebro en secciones coronales de 450 m y usa una lámina húmeda para recoger el cerebro seccionado en un nuevo plato de Petri lleno de HBSS suplementado en frío. Para diseccionar la SVZ, usa fórceps para separar las rodajas coronales de una manera de anterior a posterior hasta llegar a las rodajas con los ventrículos laterales, bajo un microscopio de disección. Cortar la capa delgada de tejido que rodea la pared lateral de los ventrículos (que corresponde a la SVZ) con fórceps finos, excluyendo el parénquima estriado y el cuerpo calloso. Aislar la SVZ colocando la punta de los fórceps en las esquinas laterales del ventrículo lateral: uno inmediatamente debajo del cuerpo calloso y el otro en el tejido inmediatamente adyacente a la zona ventral del ventrículo lateral. Luego, corte una pequeña línea de tejido que rodea el ventrículo lateral. Recoger el tejido diseccionado en un tubo de muestra con solución suplementada de HBSS previamente identificada como SVZ.NOTA: Excluya la SVZ en rodajas donde comiencen a aparecer tanto los ventrículos laterales como la formación del hipocampo. Ir a través de todas las rebanadas después de la microdisección SVZ de una manera anterior a posterior y llegar a la formación del hipocampo. El uso de fórceps descarta la primera rebanada con hipocampo donde DG sigue siendo irreconocible. Para eliminar la DG, primero aísle el hipocampo de las rebanadas. Vuelva a enfocar el microscopio para visualizar los bordes alrededor de DG. Diseccionar la parte DG realizando un corte entre la región DG y CA1 seguido de un corte vertical entre la región DG y CA3 utilizando fórceps. Retire la fimbria y cualquier tejido adyacente.NOTA: En los animales P1-3, la DG es casi indistinguible del cuerno de Ammón, pero muestra una pequeña punta. Recoger el tejido diseccionado en un tubo de muestra que contenga soluciones suplementadas de HBSS previamente identificadas como DG.NOTA: La lesión general en el hipocampo o en los alrededores hará más difícil aislar la DG. El uso de un atlas del cerebro del ratón postnatal es esencial cuando el usuario no está familiarizado con el aislamiento de la SVZ y el tejido DG de las secciones coronales. 3. Disociación de tejidos Para disociar el tejido SVZ y DG presente en sus respectivos tubos, agregue trippsin-EDTA 0,05% para tener una concentración final de 5-10% de trippsina-EDTA 0,05% en HBSS. Incubar durante aproximadamente 15 min a 37 oC, hasta que el tejido se agrupe. Lavar el tejido de la trippsina retirando el medio y añadiendo 1 ml de nueva solución suplementada de HBSS por 4 veces consecutivas. Retire el HBSS y resuspenda el tejido digerido en 1 ml de SFM complementado con 10 ng/ml de EGF y 5 ng/mL bFGF. Disociar mecánicamente el pellet pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 7 x 10 veces utilizando una pipeta P1000, hasta obtener una solución celular homogénea.ADVERTENCIA: Una disociación mecánica excesiva puede conducir a un aumento de la muerte celular y afectará negativamente el crecimiento celular posterior. 4. Ensayo de par de células para estudiar el destino celular Antes del experimento, prepare placas recubiertas de 24 pocillos para cultivos monocapa adherentes de acuerdo con las secciones 8-10. Para contar el número de células SVZ o DG (obtenidas en la sección 3) que se van a chapar, utilice una solución que contenga 0.2% de color azul Trypan y cuente las células usando un hemogómetro. Diluir la suspensión celular disociada en SFM suplementada con 5 ng/ml EGF y 2,5 ng/mL bFGF (bajo EGF/bFGF) a una densidad de 11.300 células/cm2 y placarlas en cubiertas de vidrio recubierto. Después de las 24 h, fijar las células para la inmunocitoquímica contra marcadores NSC como sexo determinante región Y-caja 2 (Sox2) y nestin, así como con un marcador del linaje neuronal (a saber, doublecortin [DCX], para las neuronas inmaduras) (ver sección 14).NOTA: Sox2 es un marcador de SCN que se someten a mitosis. Sox2+/+ pares celulares resultantes de una sola división celular progenitor a refleja la expansión de células madre7. 5. Expansión de las células madre neurales postnatales como neuroesferas Para determinar la densidad de la suspensión celular SVZ o DG disociada (obtenida en la sección 3), cuente las células utilizando un hematitómetro. Diluir SVZ y DG suspensión de células simples a una densidad de 2 x 104 células/ml en SFM complementado con 10 ng/mL EGF y 5 ng/mL bFGF. Células SVZ y DG de semillas en platos Petri de 60 mm sin recubrimiento con un volumen final de plato de 5 ml/Petri. Incubar células SVZ y DG durante 6 a 8 días y 10 a 12 días, respectivamente para formar neuroesferas primarias, a 37 oC con un 5% de CO2.NOTA: Los días de incubación más que los mencionados pueden promover la agregación de las neuroesferas y mayores niveles de muerte celular en el centro de la neuroesfera. Cuando la mayoría de las neuroesferas tienen un diámetro de 150-200 m, realizar el paso de la neuroesfera.NOTA: El paso de las neuroesferas cuando no tienen un diámetro adecuado compromete todos los pasos siguientes. 6. El paso de las neuroesferas NOTA: El siguiente protocolo se puede aplicar para ampliar las neuroesferas SVZ y DG. Para pasar las neuroesferas, recoger el SFM con factores de crecimiento que contienen neuroesferas de los platos Petri de 60 mm y centrífuga durante 5 min a 300 x g. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet de la neuroesfera utilizando un kit de disociación química (ratón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante(Tabla de materiales).NOTA: Observe los tiempos de incubación con precisión, ya que son cruciales para el rendimiento. Centrífuga durante 5 min a 300 x g,retire el sobrenadante y agregue 1 ml de SFM complementado con 10 ng/mL EGF y 5 ng/mL bFGF. Triturar hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces con una pipeta P1000 para disociar las neuroesferas. Cuente el número de células que utilizan una solución que contiene 0.2% de color azul Trypan y un hematómetro. Células resembradas a una densidad de 2 x 104 células/ml en platos Petri de 60 mm sin recubrimiento. Incubar células SVZ y DG durante 6 a 8 días y 10 a 12 días, respectivamente para obtener neuroesferas secundarias, a 37 oC con 5% de CO2.NOTA: Se puede acceder a la capacidad de autorenovación de los SVZ y DG derivados de los SCCP siguiendo las secciones 5 y 6 del protocolo. Para ello, las células SVZ y DG de semillas a una densidad de 1,0 x 104 células/ml (en placas de 24 pocillos sin recubrimiento) en medio SFM de crecimiento que contiene 5 ng/mL EGF y 2,5 ng/mL bFGF (bajo EGF/bFGF). Cuente el número de neuroesferas primarias y secundarias resultantes. 7. Almacenamiento de neuroesferas Recoger el medio que contiene las neuroesferas (obtenido de los pasos 5.3 y 6.7) de los platos Petri de 60 mm. Centrífuga durante 5 min a 300 x g y desechar el sobrenadante. Lavar las células 2x con 1 ml de HBSS (5 min a 300 x g). Centrífuga durante 5 min a 300 x g,desechar el sobrenadante y almacenar el pellet de las neurosferas a -20 oC para el análisis de la biología molecular. 8. Procedimiento de placa de recubrimiento PDL Para preparar la solución 1 (tampón de borato de 0,1 M), pesar 3,92 g de ácido bórico y diluir en 400 ml de agua de alta pureza. Ajuste el pH a 8,2 y haga hasta 500 ml con agua de alta pureza. Para preparar la solución 2 (tampón de borato de 0,167 M), pesar 10,3 g de ácido bórico y diluir en 900 ml de agua de alta pureza. Ajuste el pH a 8,2 y haga hasta 1.000 ml con agua de alta pureza. Para reconstituir poli-D-lisina (PDL) (1 mg/ml en tampón de borato de 0,1 M), diluir 100 mg de PDL en 100 ml de solución 1. Hacer alícuotas de 10 ml para usar inmediatamente o congelar y almacenar a -20 oC. Bajo el flujo laminar, añadir 1 cubreobjetos por pozo y esterilizar bajo luz UV durante 15 min. Utilice la PDL reconstituida o el deshielo congelado de la PDL reconstituida. Prepare la solución final de 100 g/ml PDL en tampón de borato de 0,167 M añadiendo 10 ml de PDL reconstituido a 90 ml de solución 2. Añadir la solución final a los pozos durante un mínimo de 2 h a la noche a 37 oC.NOTA: Para placas de 24 pocillos, añada un volumen de 500 ml en cada poca. Retire la solución y lave 3veces con agua de alta pureza. Deje que los cubreobjetos se sequen en la campana de flujo laminar. Deje las placas de cultivo de varios pozos a 4oC. 9. Procedimiento de placa de recubrimiento PDL/Laminin En el día 1, cubra las placas con PDL como se describe en la sección 8. El día 2, retire la solución PDL y lave 3 veces con agua de alta pureza. Dejar secar. Preparar 5 g/ml de laminin en SFM frío carente de factores de crecimiento. Añadir laminina disuelta a las cubiertas y incubar a 37 oC durante la noche.NOTA: Para placas de 24 pocillos, añada un volumen de 500 ml en cada poca. Retire el laminin con una pipeta.NOTA: No lave los labios de la minina. Usar inmediatamente o almacenar a -20 oC. 10. Procedimiento de recubrimiento de poli-L-ornitina (PLO) /laminina Debajo del flujo laminar, añadir un cubreobjetos por pozo y esterilizar bajo luz UV durante 15 min. Añadir 0.01% de solución PLO a cada pozo durante 20 min a temperatura ambiente (RT).NOTA: Para placas de 24 pocillos, añada un volumen de 500 ml en cada poca. Retire la solución y lave 3 veces con PBS esterilizado 1x. Dejar secar. Preparar 5 g/ml de laminin en 1x PBS estéril. Incubar durante 2 h a 37oC. Retire el laminin.NOTA: No lave los labios de la minina. Utilícelo inmediatamente.NOTA: Asegúrese de que el tapón esté completamente cubierto por la solución DeLP tocando suavemente el tapón con una punta de pipeta. Cuando se agitan, las placas multi-pozo no deben hacer ningún sonido. 11. Evaluación de la neuritogénesis mediante la generación de una monocapa diferenciada de células Recoger los medios que contengan neuroesferas de 60 mm de platos Petri (obtenidos de la sección 5) y centrífuga durante 5 min a 300 x g a RT. Desechar el sobrenadante y disociar el pellet de las neuroesferas en 1 ml de disociación PBS (es decir, PBS sin Mg2+/Ca2+ y con EDTA [2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4 y 0,5 mM EDTA 4Na, a pH a 7,40]) incubando durante 15 min seguida de disociación mecánica. Alternativamente, disociar las neuroesferas utilizando un kit de disociación química (ratón) (Tabla de materiales). Centrífuga durante 5 min a 300 x g en RT y desechar el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en 1 ml de SFM desprovisto de factores de crecimiento. Determinar la densidad celular utilizando un hematitómetro. Diluir la suspensión celular disociada en SFM carente de factores de crecimiento a una densidad de 3.766 células/cm2 y células de placa en cubiertas de vidrio recubiertas en placas de 24 pocillos. Después de 1 o 3 días, fijar las células para la inmunocitoquímica contra una proteína del citoesqueleto (ver sección 14). 12. Diferenciación de cultivos de la neuroesfera NOTA: Las neuroesferas obtenidas de la expansión celular, ya sea a partir de neuroesferas primarias o pasajeras (obtenidas en las secciones 5 o 6) se pueden diferenciar en células de diferentes linajes neuronales. Cuando las neuroesferas tengan un diámetro de 150 a 200 m, recoja 25 ml de medio de suspensión de la neuroesfera y placa en cubiertas de vidrio recubiertas, en placas de 24 pocillos.NOTA: Para recoger más neuroesferas, gire suavemente la placa Petri para concentrar las neuroesferas en el centro. Luego, pipeta del centro. Poner las placas en una incubadora a 37 oC durante 15 minutos para que las neuroesferas se adhieran al sustrato. A continuación, añadir 500 s de SFM carente de factores de crecimiento (condiciones diferenciativas). Después de 24 h, reemplace el medio por un SFM fresco carente de factores de crecimiento. Diferenciar para diferentes puntos de tiempo (por ejemplo, 2 y 7 días in vitro, DIV2 y DIV7, respectivamente) con 5% co2 y 95% de aire atmosférico a 37 oC.NOTA: La supervivencia celular, la proliferación y la diferenciación se pueden analizar utilizando diferentes ensayos celulares. 13. Ensayos de biología celular Ensayo de supervivencia celular Exponga las neuroesferas chapadas a un yoduro de propiduro (PI) de 3 g/ml durante 30 minutos antes de la fijación celular en la incubadora a 37 oC.NOTA: PI es un agente autofluorescente que sólo es capaz de entrar en células con integridad de membrana comprometida8. Se pueden utilizar otros métodos para analizar la supervivencia celular, como la tinción de la caspasa 3 o el ensayo de etiquetado de punta de soroxinucleordendilar transferasa terminal (TUNEL). Ensayo de proliferación celular Exponga las neuroesferas chapadas a 10 m 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) durante 4 h antes de la fijación en la incubadora a 37 oC.NOTA: BrdU es un análogo sintético de timidina que se puede incorporar durante la síntesis de ADN en células proliferantes9. Ensayo de diferenciación celular Exponga las neuroesferas chapadas de 7 días de edad a 10 m de Brdu en las primeras 24 h, en la incubadora a 37 oC. Renovar el SFM desprovisto de factores de crecimiento (condiciones diferenciadoras) y permitir que las células se desarrollen en ausencia de BrdU durante los siguientes 6 días hasta la fijación.NOTA: Estos experimentos de búsqueda de pulsos, mediante el etiquetado mediante el etiquetado mediante marcadores de células neuronales maduras, permiten la evaluación de células progenitoras que se diferencian en células maduras durante el protocolo. 14. Inmunomanchación de cultivos de la neurosfera Fijación celular Preparar un 4% de paraformaldehydo (PFA) en 1pbS y almacenar a 4 oC o -20 oC. Retire el SFM desprovisto de factores de crecimiento de los pozos y agregue, a cada pocal, 500 oL de 4% de PFA a 4 oC durante 20 min a RT. Lavar 3x con 1x PBS, durante 5 min cada vez, las cubiertas que contienen neuroesferas diferenciadas. Conservar los cubreobjetos hasta que se utilicen en 500 oC de 1pbS a 4 oC.NOTA: Si el experimento no tiene BrdU, vaya al paso 14.3. Método de desnaturalización (solo para experimentos BrdU) Preparar 1 M HCl a 37oC. Enjuague los labios de las cubiertas 3veces en 1x PBS. Permeabilizar las células durante 30 minutos en PBS que contienen 1% de tensioactivo no iónico (por ejemplo, Tritón X-100). Desnaturalidad dsDNA con 1 M HCl precalentado a 37oC durante 30 o 40 min a 37 oC (300 oC/pozo). Lavar los pozos 4veces con 1x PBS. Permeabilización y bloqueo Enjuague los cubreobjetos en 1pbS durante 5 min. Incubar durante 1,5 h con un tensioactivo no iónico al 0,5% y una albúmina sérica bovina (BSA) al 3% en 1pbS (300 ol/pozo).NOTA: Para NeuN, utilice 6% de BSA en 1pbS. Incubación y montaje En el día 1, sin lavar, incubar células con anticuerpos primarios(Tabla de Materiales)en tensioactivo no iónico al 0,1% y 0,3% de BSA en 1x PBS en la cámara de incubación (para placas de 24 pocillos utilizan 20 l/pozo). Deje los cubreobjetos incubando durante la noche a 4 oC de luz protegida si los anticuerpos se conjugan con un fluoróforo. En el día 2, devolver las tapasde los labios a sus respectivos pozos y enjuagar 3veces en 1x PBS durante 5 min. Contramancha con anticuerpos secundarios conjugados por fluorescencia apropiados (dilución 1:200) y con Hoechst 33342 de 12 o menospara la fluorescencia para 2 h a RT y luz protegida en la cámara de incubación (20 l/tapa). Lavar los labios de las cubiertas 3x en 1x PBS durante 5 min. Monte los cubreobjetos en las guías del microscopio utilizando 5 l/tapa de medio de montaje de fluorescencia. Deje que los cubreobjetos se sequen al aire en RT, protegidos de la luz, durante 1 día. Microscopía Vea y adquiera imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia. Para cada condición, utilice tres réplicas. Realice recuentos celulares en cinco campos microscópicos independientes en cada cubreportada con un objetivo de 40x (100 células por campo). 15. Preparación de soluciones de stock de EGF y bFGF Solución de stock eGF Para reconstituir eGF liofilizado, diluir el producto en agua de alta pureza para alcanzar una concentración final de 20 g/ml. Aliquot y almacenar en microtubos a -5 a -20 oC. solución bursátil bFGFNOTA: bFGF debe reconstituirse con una solución de 10 mM Tris, pH 7.6. Centrifugar el vial brevemente antes de abrirlo para llevar el contenido al fondo. Preparar 50 mL de 10 mM Tris, pH 7.6. Para ello, pese 60,57 mg de Tris ((HOCH2)3CNH2) y diluya en 40 ml de agua de alta pureza. Ajuste el pH a 7,6 y haga hasta 50 ml con agua de alta pureza. Preparar 10 mL de 0,1% de BSA en Tris de 10 mM, pH 7,6. Para ello, pesar 10 mg de BSA y diluirlo en 10 ml de 10 mM Tris. Soluciones de filtro preparadas en los pasos 15.2.2 y 15.2.3 con un filtro de 0,22 m bajo una campana de flujo laminar. Reconstituir 10 g de bFGF en 1.000 éL de 0,1% de BSA en Tris de 10 mM con pH 7,6 para alcanzar una concentración final de 10 g/ml. Aliquot en microtubos a -20oC durante un máximo de 6 meses.