Изоляция и расширение нейросфер от постнатальных (P1'3) Мыши нейрогенных ниш

Все эксперименты проводились в соответствии с законодательством Европейского сообщества (86/609/EEC; 2010/63/EU; 2012/707/EU) и португальским (DL 113/2013) для защиты животных, используемых в научных целях. Протокол был одобрен “институциональным органом по защите животных МММ – ОРБЕА-ИММ и Национальным компетентным органом – DGAV (Direc’o Geral de Alimenta’o e Veterin’ria) “. 1. Базовая установка и подготовка среды культуры В день вскрытия, подготовить соответствующее количество роста среды, соответствующей сыворотки свободной среды (SFM) состоит из Dulbecco в модифицированных орлов среды (DMEM) / F12 с L-глютамина (Таблица материалов) дополнен100 U/mL пенициллин и 100 г /мL streptomycin (пен/стрептоцин, 17, B, 17 с также 10 нг /мл EGF и 5 нг/мл bFGF. Разогрейте культуру среды до 37 градусов по Цельсию в водяной бане.ПРИМЕЧАНИЕ: Объем среды роста зависит от количества щенков, для 5 щенков готовят 100 мл (50 мл для СВз и 50 мл для DG); однако после подсчета количества ячеек (шаг 5.1) точный объем необходимо будет скорректировать. Для микродиссекции SV и DG, подготовить кальция и магния свободного Хэнкса сбалансированного солевая раствор (HBSS) вскрытие среды дополнены 100 U/mL перо / стрептококк.ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте 50-100 мл среды вскрытия. Настройте микроскоп по рассечению и подготовьте инструменты, необходимые для удаления мозга (ножницы и маленькие шпательные) и для микрорассежей СВз и ДГ (маленькие ножницы Dumont, #7 щипцы, #5 щипцы, #5S щипцы) замачивания в 70% этанола. 2. Сбор послеродового (P1-3) мозга мыши и sV /DG микродиссекций Приготовьте 60 мм посуду Петри (площадь роста 21 см2)с HBSS, дополненной ручкой/стрептом и 2 пробными трубками (один для СВз и один для ГД) с 500 л дополненного HBSS каждый. Эвтаназия мышей щенки (P1’3) в соответствии с протоколом, утвержденным институционального ухода за животными объекта / руководящих принципов. Выполните обезглавливание с одним разрезом с острыми ножницами у основания ствола мозга. Удерживая вентральную часть тела у основания головы и используя небольшие остроконечные ножницы, сделайте разрез средней линии кожи по всей длине головы, тем самым показывая поверхность черепа. Сделайте продольное разрез у основания черепа и продолжайте резать вдоль сагитального шва с помощью небольших ножниц с неглубоким углом, чтобы избежать повреждения структур мозга. Очистите череп в стороны с помощью изогнутых щипц и разоблачить мозг.ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что рассекающие инструменты свободны от этанола, прежде чем прикасаться к мозгу. Изолировать мозг от черепа с помощью небольшого шпателя, скользя под основанием мозга, чтобы сократить черепные нервы и кровеносные сосуды, которые подключены к основанию мозга, и передать мозг в чашку Петри, содержащую холодный дополненный раствор HBSS. Поместите чашку Петри, содержащую мозг, под рассекающим микроскопом при низком увеличении и поместите мозг на его андреевую поверхность. Используя тонкие щипцы, удалить одра со брюшной стороны мозга и обонятельные луковицы, удерживая мозг в положении мозжечка. Поверните мозг на брюшной аспект и снимите остальные оранжереи.ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление дозалических олова является важным шагом для обеспечения правильной нарезки мозга. Откажитесь от мозжечка сделать разрез с помощью щипцов. Поместите фильтровальную бумагу размером 11 мкм на тканевый измельчитель(Таблица материалов)и установите мозг на фильтровальную бумагу с помощью изогнутых щипц. Нарезать мозг на 450 мкм корональных секций и использовать влажный ламина для сбора разделенных мозга в новое блюдо Петри заполнены холодной дополненной HBSS. Чтобы вскрыть SV, используйте щипцы, чтобы отделить корональные ломтики в передней до задней моды до достижения ломтики с боковыми желудочками, под рассекающим микроскопом. Вырезать тонкий слой ткани, окружающей боковую стенку желудочков (что соответствует SV) с тонкими щипками, за исключением стриатал паренхимы и корпус мозоли. Изолировать SV, разместив кончик щипцы в боковых углах бокового желудочка: один непосредственно под корпусом мозоли, а другой в ткани непосредственно прилегающих к брюшной области бокового желудочка. Затем вырежьте небольшую линию ткани, окружающую боковой желудочек. Соберите расчлененные ткани в образец трубки с дополнением раствором HBSS, ранее идентифицированным как SV.ПРИМЕЧАНИЕ: Исключить SV в ломтиках, где как боковые желудочки и формирования гиппокампа начинают появляться. Пройдите через все ломтики после микродиссекции SV’ в передней к задней моды и достичь формирования гиппокампа. Использование щиптем отказаться от первого ломтика с гиппокампа, где ГД до сих пор неузнаваемым. Чтобы удалить DG, сначала изолировать гиппокампа от ломтиков. Перефокусируйте микроскоп, чтобы визуализировать границы вокруг DG. Вскрыть часть DG, выполняя разрез между DG и CA1 региона следуют вертикальные разреза между DG и CA3 региона с помощью щипки. Удалите фимбрию и любые смежные ткани.ПРИМЕЧАНИЕ: В P1-3 животных, DG почти неотличимы от рога Аммона, но отображает небольшой наконечник. Соберите расчлененные ткани в образец трубки, содержащей дополнительные решения HBSS, ранее идентифицированные как DG.ПРИМЕЧАНИЕ: Общая травма гиппокампа или прилегающей территории сделает его более трудным для изоляции ГД. Использование атласа послеродового мозга мыши имеет важное значение, когда пользователь не знаком с изоляцией ткани SV и DG от корональных секций. 3. Диссоциация тканей Чтобы разъединить ткани SV и DG, присутствующие в их соответствующих трубках, добавьте трипсин-EDTA 0,05%, чтобы иметь окончательную концентрацию 5-10% трипсина-ЭДТА 0,05% в HBSS. Инкубировать в течение примерно 15 мин при 37 градусах Цельсия, пока ткань не слипется вместе. Вымойте ткань из трипсина, удалив средства массовой информации и добавив 1 мл нового HBSS дополненного раствора в течение 4 раз подряд. Удалить HBSS и resuspend переваренной ткани в 1 мл SFM дополнены 10 нг / мл EGF и 5 нг /мл bFGF. Механически разъединяйте гранулы, аккуратно прокладывая вверх и вниз примерно в 7–10раз с помощью пипетки P1000, пока не получитодно однородное клеточное решение.ВНИМАНИЕ: Чрезмерная механическая диссоциация может привести к увеличению клеточной смертности и негативно скажется на последующем росте клеток. 4. Cell-пара анализ для изучения судьбы клеток До начала эксперимента подготовьте покрытые 24-колодствуйные пластины для адептовых монослойных культур по разделам 8-10. Для подсчета количества sV или DG-клеток (полученных в разделе 3) для покрывало, используйте раствор, содержащий 0,2% Трипан синий и рассчитывать клетки с помощью гематоцитометра. Разбавить разобщенную клеточную суспензию в SFM, дополненную 5 нг/мл EGF и 2,5 нг/мл bFGF (низкий EGF/bFGF) при плотности 11300 клеток/см2 и пластины их на покрытых стеклянными крышками. После 24 ч, исправить клетки для иммуноцитохимии против NSC маркеров, таких как пол определения области Y-box 2 (Sox2) и nestin, а также с маркером нейрональной линии (а именно двойной кортохин »DCX), для незрелых нейронов) (см. раздел 14).ПРИМЕЧАНИЕ: Sox2 является маркером NSCs, которые проходят митоз. Sox2q /) клеточные пары в результате одного деления клеток-прародителей отражает расширение стволовых клеток7. 5. Расширение послеродовых нервных стволовых клеток как нейросфер Чтобы определить плотность разъединенных СВЗ или DG-клеточной подвески (полученной в разделе 3), подсчитайте клетки с помощью гематоцитометра. Разбавленная суспензия СВз и ДГ с плотностью 2 х 104 ячеек/мл в SFM дополнена 10 нг/мл EGF и 5 нг/мл bFGF. Семенные клетки СВЗ и DG в непокрытом 60 мм чашках Петри с конечным объемом 5 мл/петри блюдо. Инкубировать SV и DG-клетки в течение 6-8 дней и 10-12 дней, соответственно, для формирования первичных нейросфер, при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубационные дни больше, чем упомянутые могут способствовать агрегации нейросфер и более высоких уровней клеточной смерти в центре нейросферы. Когда большинство нейросфер имеют диаметр 150–200 мкм, выполняйте прохождение нейросферы.ПРИМЕЧАНИЕ: Проходя нейросферы, когда они не имеют соответствующего диаметра компромиссов все следующие шаги. 6. Пропуск нейросфер ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол может быть применен для расширения как СВз, так и DG нейросферы. Для прохождения нейросфер, собирать SFM с факторами роста, содержащими нейросферы из 60 мм Петри блюдо (es) и центрифуга в течение 5 мин при 300 х г. Откажитесь от супернатанта и повторно ежеровые нейросферные гранулы с помощью химического комплекта диссоциации (мышь) в соответствии с инструкциями производителя (Таблица материалов).ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за инкубационными временами точно, поскольку они имеют решающее значение для производительности. Центрифуга в течение 5 мин при 300 х г,удалить супернатант и добавить 1 мл SFM дополнен10 нг /мЛ EGF и 5 нг /мЛ bFGF. Triturate вверх и вниз примерно в 10 раз с пипеткой P1000, чтобы разъединить нейросферы. Подсчитайте количество клеток, используя раствор, содержащий 0,2% Трипан синий и гематоцитометр. Пересеянные клетки при плотности 2 х 104 ячейки/мл в непокрытом 60 мм чашках Петри. Инкубировать SV и DG-клетки в течение 6-8 дней и 10-12 дней, соответственно, для получения вторичных нейросфер, при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.ПРИМЕЧАНИЕ: К возможностям самообновления NSPC, полученным из СВз- и DG, можно получить следующие разделы протокола 5 и 6. Для этого, семенные sV и DG-клетки при плотности 1,0 х 104 ячейки/мл (в непокрытых 24-колодцах пластин) в среде роста SFM, содержащей 5 нг/мл EGF и 2,5 нг/мл bFGF (низкий EGF/bFGF). Подсчитайте количество полученных первичных и вторичных нейросфер. 7. Хранение нейросфер Соберите среду, содержащую нейросферы (полученные из шагов 5,3 и 6,7) из 60 мм посуды Петри. Центрифуга в течение 5 мин при 300 х г и отбросить супернатант. Вымойте клетки 2x с 1 мл HBSS (5 мин при 300 х г). Центрифуга в течение 5 мин при 300 х г,отбросить супернатант и хранить гранулы нейросфер при -20 градусов по Цельсию для анализа молекулярной биологии. 8. Процедура покрытия PDL Для приготовления раствора 1 (0,1 м боратовый буфер) взвесьте 3,92 г борной кислоты и разбавьте в 400 мл высокой чистоты воды. Отрегулируйте рН до 8,2 и сделайте до 500 мл с высокой чистотой воды. Для приготовления раствора 2 (0,167 м боратбуфера) взвесьте 10,3 г борной кислоты и разбавьте в 900 мл высокой чистоты воды. Отрегулируйте рН до 8,2 и сделать до 1000 мл с высокой чистотой воды. Для восстановления поли-D-лизин (PDL) (1 мг/мл в буфере бората 0,1 м), разбавьте 100 мг PDL в 100 мл раствора 1. Сделать aliquots 10 мл, чтобы использовать немедленно или заморозить и хранить при -20 градусов по Цельсию. Под ламинарным потоком добавьте 1 крышку на скважину и стерилизуйте под ультрафиолетовым светом в течение 15 минут. Используйте восстановленный PDL или оттепель замороженных восстановленных PDL. Подготовьте окончательное решение 100 мкг/мл PDL в буфере бората 0,167 М, добавив 10 мл восстановленного PDL до 90 мл раствора 2. Добавьте окончательное решение к скважинам минимум на 2 ч до 37 градусов по Цельсию.ПРИМЕЧАНИЕ: Для 24-колодных пластин добавьте объем по 500 л в каждую скважину. Снимите раствор и промойте 3x с высокой чистотой воды. Пусть крышки высохнут в ламинарном капоте потока. Оставьте многокомнатные культурные тарелки при 4 градусах Цельсия. 9. PDL/Laminin процедура покрытия пластины На 1-й день, пальто пластин ы с PDL, как описано в разделе 8. На второй день снимите раствор PDL и промойте 3x с высокой чистотой воды. Дайте высохнуть. Приготовьте 5 мкг/мл ламинина в холодном SFM, лишенном факторов роста. Добавить растворенный ламинин в крышки и инкубировать при 37 градусах Цельсия в одночасье.ПРИМЕЧАНИЕ: Для 24-колодных пластин добавьте объем по 500 л в каждую скважину. Удалите ламинин с помощью пипетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Не мыть крышки из ламинина. Используйте немедленно или храните при -20 градусах Цельсия. 10. Поли-L-орнитин (PLO) /ламинина процедура покрытия Под ламинарным потоком добавьте один покрывало на скважину и стерилизуйте под ультрафиолетовым светом в течение 15 минут. Добавьте 0,01% оПО раствор к каждому колодцу в течение 20 минут при комнатной температуре (RT).ПРИМЕЧАНИЕ: Для 24-колодных пластин добавьте объем по 500 л в каждую скважину. Удалить раствор и вымыть 3x со стерилизованной 1x PBS. Дайте высохнуть. Подготовка 5 мкг/мл ламинина в стерильных 1x PBS. Инкубировать в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия. Удалите ламинин.ПРИМЕЧАНИЕ: Не мыть крышки из ламинина. Используйте немедленно.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что крышка полностью покрыта раствором ООП, осторожно нажав на крышку с помощью наконечника пипетки. При встряске многослойные пластины не должны издать звук. 11. Оценка неуритогенеза путем создания дифференцированного монослойа клеток Соберите носители, содержащие нейросферы из 60 мм посуды Петри (получены из раздела 5) и центрифуги в течение 5 мин при 300 х г на РТ. Отбросьте супернатант и разъедините гранулы нейросфер в 1 мл диссоциации PBS (т.е., PBS без Mg2 “/Ca2” и с EDTA 2,7 мм KCl, 1,5 мМ KH2PO4, 137 mM NaCl, 8,1 мМ Na 2 HPO4и 0,5 мМ EDTA 4Na, при рН 7,40) путем инкубации в течение 15 минут с последующей механической диссоциацией.4 Кроме того, диссоциировать нейросферы с помощью химического комплекта диссоциации (мышь) (Таблица материалов). Центрифуга в течение 5 мин при 300 х г на RT и отбросить супернатант. Приостанавливайте действие клеточных гранул в 1 мл SFM, лишенных факторов роста. Определить плотность клеток с помощью гематоцитометра. Разбавить разобщенную клеточную суспензию в SFM, лишенную факторов роста при плотности 3766 клеток/см2, и пластинки на покрытых стеклянных крышках в 24-колодцах пластин. После 1–3 дней исправьте клетки для иммуноцитохимии против белка цитоскелета (см. раздел 14). 12. Дифференциация нейросферных культур ПРИМЕЧАНИЕ: Нейросферы, полученные от расширения клеток, либо из первичных или проходяных нейросфер (полученных в разделах 5 или 6) могут быть дифференцированы в клетки из различных нейронных линий. Когда нейросферы имеют диаметр 150-200 мкм, соберите 25 qL нейросферной подвески среднего и пластины на покрытых стеклянных крышках, в 24-колодцах пластин.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы собрать больше нейросфер, осторожно поверните чашку Петри, чтобы сконцентрировать нейросферы в центре. Затем, пипетка из центра. Поместите пластины в инкубатор при 37 градусах по Цельсию в течение 15 мин, чтобы нейросферы придерживались субстрата. После этого добавьте 500 л SFM, лишенных факторов роста (дифференимационные условия). После 24 ч замените среду свежим SFM, лишенным факторов роста. Дифференцируйте для различных точек времени (например, 2 и 7 дней in vitro, DIV2 и DIV7, соответственно) с 5% CO2 и 95% атмосферным воздухом при температуре 37 градусов по Цельсию.ПРИМЕЧАНИЕ: Выживание клеток, пролиферация и дифференциация могут быть проанализированы с помощью различных анализов клеток. 13. Анализы клеточной биологии Выживаемость клеток Выставляют покрыные нейросферы до 3 мкг/мл пропидийййййййй (PI) в течение 30 минут до фиксации клеток в инкубаторе при 37 градусах Цельсия.ПРИМЕЧАНИЕ: PI является автоматическим флуоресцентным агентом, который способен вводить только клетки с нарушенной целостностью мембраны8. Другие методы для анализа выживания клеток могут быть использованы, такие как caspase 3 окрашивания или терминал арении deoxynucleotidyl transferase dUTP ник-конец маркировки (TUNEL) анализ. Пролиферация клеток Выставляют покрывало нейросферы до 10 мкм 5-бромо-2′-deoxyuridine (BrdU) за 4 ч перед фиксацией в инкубаторе при 37 градусах Цельсия.ПРИМЕЧАНИЕ: BrdU является синтетическим аналогом тимидина, который может быть включен во время синтеза ДНК в пролиферирующих клетках9. Проверка дифференциации клеток Выставляют 7-дневные покрыванные нейросферы до 10 мкм BrdU в первые 24 ч, в инкубаторе при 37 градусах Цельсия. Обновите SFM, лишенный факторов роста (дифференимационных условий) и позвольте клеткам развиваться в отсутствие BrdU в течение следующих 6 дней до фиксации.ПРИМЕЧАНИЕ: Эти эксперименты пульс-погони, путем совместной маркировки с маркерами зрелых нервных клеток, позволяют оценку клеток-прародителей, которые дифференцируются в зрелые клетки во время протокола. 14. Иммуностоинг нейросферных культур Фиксация ячеек Приготовьте 4% параформальдегида (PFA) в 1x PBS и храните при 4-C или -20 градусов по Цельсию. Удалите SFM, лишенный факторов роста, из скважин и добавьте, к каждой скважине, 500 qL 4% PFA при 4 кв. м в течение 20 мин на RT. Вымойте 3x с 1x PBS, в течение 5 минут каждый раз, крышки, содержащие дифференцированные нейросферы. Хранить крышки до использования в 500 зл и в 1x PBS при 4 градусах Цельсия.ПРИМЕЧАНИЕ: Если эксперимент не имеет BrdU, перейдите к шагу 14.3. Метод денатурации (только для экспериментов BrdU) Подготовка 1 M HCl при 37 градусах Цельсия. Промыть охватывает 3x в 1x PBS. Пермяки ячеек в течение 30 мин в PBS, содержащий 1% неионический сурфактант (например, Тритон X-100). Денатурная dsDNA с 1 M HCl предварительно нагревается до 37 градусов по Цельсию в течение 30-40 мин при 37 кв/кв (300 л/ну). Вымойте скважины 4x с 1x PBS. Пермяки и блокирование Промыть покрывает в 1x PBS в течение 5 мин. Инкубировать 1,5 ч с 0,5% неионическим сурфактантом и 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 1x PBS (300 л/ну).ПРИМЕЧАНИЕ: Для NeuN, используйте 6% BSA в 1x PBS. Инкубация и монтаж На 1 день, без мытья, инкубировать клетки с первичными антителами(Таблица материалов) в 0,1% неионический сурфактант и 0,3% BSA в 1x PBS в инкубационной камере (для 24-колодцев использовать 20 Л/ну). Оставьте крышки, инкубирующие на ночь при 4-C свет защищены, если антитела спрягаются в флюорофор. На второй день, возвращение охватывает крышки в их соответствующих скважин и промыть 3x в 1x PBS в течение 5 мин. Противокосятное пятно с соответствующей флуоресценцией конъюгированных вторичных антител (разбавление 1:200) и с 12 мкг/мл Hoechst 33342 в 1x PBS для 2 ч на РТ и свет защищен в инкубационной камере (20 л/крышка). Мытье охватывает 3x в 1x PBS в течение 5 мин. Гора охватывает скользит на микроскоп слайды с помощью 5 Л / coverslip флуоресценции монтажа среды. Пусть крышки покрывает воздух сухим на RT, защищены от света, в течение 1 дня. Микроскопии Просматривайте и приобретайте изображения с помощью флуоресцентного микроскопа. Для каждого состояния используйте три репликации. Выполнение клеток в пяти независимых микроскопических полей в каждом coverslip с 40x цель (100 ячеек на поле). 15. Подготовка фондовых решений EGF и bFGF Акционерное решение EGF Чтобы воссоздать лиофилизированный EGF, разбавить продукт в воде высокой чистоты, чтобы достичь конечной концентрации 20 мкг/мл. Aliquot и хранить в микротрубках при от -5 до -20 градусов по Цельсию. Акционерное решение bFGFПРИМЕЧАНИЕ: bFGF должен быть восстановлен с раствором 10 мМ Трис, рН 7.6. Centrifuge флакон кратко перед открытием довести содержание на дно. Приготовьте 50 мл 10 мм Трис, рН 7,6. Для этого, весят 60,57 мг Tris ((HOCH2)3CNH2) и разбавить его в 40 мл воды высокой чистоты. Отрегулируйте рН до 7,6 и сделайте до 50 мл с высокой чистотой воды. Подготовка 10 мл 0,1% BSA в 10 мм Трис, рН 7,6. Для этого взвесьте 10 мг BSA и разбавьте его в 10 мл 10 мм Трис. Фильтровые решения, подготовленные шагами 15.2.2 и 15.2.3 с фильтром 0,22 мкм под ламинарным капотом потока. Восстановите 10 мкг bFGF в 1000 л 0,1% BSA в 10 мМ Трис с рН 7,6 для достижения конечной концентрации 10 мкг/мл. Aliquot в микротрубки при -20 градусах по Цельсию в течение максимум 6 месяцев.