Isolamento e Expansão das Neuroesferas a partir de Nichos Neurogênicos de Camundongos (P1-3)

Todos os experimentos foram realizados de acordo com a legislação da Comunidade Europeia (86/609/CEE; 2010/63/UE; 2012/707/UE) e português (DL 113/2013) para a proteção de animais utilizados para fins científicos. O protocolo foi aprovado pelo “Órgão institucional de Bem-Estar Animal do IMM – ORBEA-iMM e pela Autoridade Nacional competente – DGAV (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária)”. 1. Configuração básica e preparação do meio cultural No dia da dissecção, prepare a quantidade adequada de meio de crescimento correspondente ao meio sem soro (SFM) composto pelo meio de águia modificado de Dulbecco [(DMEM)/F12 com L-glutamina](Tabela de Materiais)complementado com 100 penicilina u/mL e 100 μg/mL estreptomicina (caneta/estreptomia), 1% B27, com também 10 ng/mL EGF e 5 ng/mL bFGF. Aqueça o meio de cultura a 37 °C em banho-maria.NOTA: O volume de meio de crescimento depende do número de filhotes, para 5 filhotes preparar ~100 mL (50 mL para SVZ e 50 mL para DG); no entanto, após a contagem do número de células (etapa 5.1) o volume exato terá que ser ajustado. Para microdissecção de SVZ e DG, prepare o meio de dissecção balanceado da solução de soro de cálcio e magnésio hanks (HBSS) suplementado com caneta/estreptococos de 100 U/mL.NOTA: Prepare 50-100 mL de meio de dissecção. Configure um microscópio de dissecção e prepare as ferramentas necessárias para remover o cérebro (tesoura e espátula pequena) e para microdissecções SVZ e DG (tesouras pequenas dumont, #7 fórceps, #5 fórceps, #5S fórceps) por imersão em 70% de etanol. 2. Colheita de cérebros de camundongos pós-natal (P1−3) e microdissecções SVZ/DG Preparar pratos de Petri de 60 mm (área de crescimento 21 cm2) com HBSS complementado com caneta/estreptococos e 2 tubos de amostra (um para SVZ e outro para DG) com 500 μL de HBSS suplementado cada. Eutanie filhotes de camundongos (P1-3) de acordo com o protocolo aprovado pela unidade de Cuidados/Diretrizes Institucionais de Animais. Realize a decapitação com uma única incisão com uma tesoura afiada na base do tronco cerebral. Segurando a parte ventral do corpo na base da cabeça e usando uma pequena tesoura pontiaguda, faça uma incisão midline na pele sobre todo o comprimento da cabeça, revelando assim a superfície do crânio. Faça uma incisão longitudinal na base do crânio e continue cortando ao longo da sutura sagital usando uma pequena tesoura com um ângulo raso possível, a fim de evitar danificar as estruturas cerebrais. Descasque o crânio para os lados usando fórceps curvos e exponha o cérebro.ATENÇÃO: Certifique-se de que os instrumentos de dissecação estão livres de etanol antes de tocar o cérebro. Isolar o cérebro do crânio usando uma pequena espátula, deslizando sob a base do cérebro para cortar os nervos cranianos e vasos sanguíneos que estão conectados à base do cérebro, e transferir o cérebro para uma placa de Petri contendo solução HBSS suplementada a frio. Coloque a placa de Petri contendo o cérebro sob um microscópio dissecando em baixa ampliação e posicione o cérebro em sua superfície dorsal. Usando pinças finas, remova as meninges do lado ventral do cérebro e das lâmpadas olfativas, mantendo o cérebro em posição pelo cerebelo. Gire o cérebro para o aspecto ventral e retire o resto das meninges.NOTA: A remoção das meninges dorsais é um passo crucial para garantir o corte cerebral correto. Descarte o cerebelo fazendo um corte usando fórceps. Coloque um papel filtro com um tamanho de poro de 11 μm em um helicóptero de tecido(Tabela de Materiais)e coloque o cérebro no papel do filtro usando fórceps pontiagudos curvos. Corte o cérebro em seções coronais de 450 μm e use uma lâmina molhada para coletar o cérebro seccionado em uma nova placa de Petri cheia de HBSS suplementada a frio. Para dissecar o SVZ, use fórceps para separar fatias coronais de forma anterior-posterior até alcançar fatias com os ventrículos laterais, sob um microscópio dissecando. Corte a fina camada de tecido ao redor da parede lateral dos ventrículos (que corresponde ao SVZ) com fórceps finos, excluindo o parenchyma estriatal e o corpo caloso. Isole o SVZ colocando a ponta dos fórceps nos cantos laterais do ventrículo lateral: um imediatamente sob o corpo caloso e o outro no tecido imediatamente adjacente à área ventral do ventrículo lateral. Em seguida, corte uma pequena linha de tecido em torno do ventrículo lateral. Coletar o tecido dissecado em um tubo de amostra com solução HBSS suplementada previamente identificada como SVZ.NOTA: Exclua o SVZ em fatias onde tanto os ventrículos laterais quanto a formação hipocampal começam a aparecer. Passe por todas as fatias após a microdissecção SVZ de forma anterior-posterior e alcance a formação hipocampal. Usando fórceps descarte a primeira fatia com hipocampo onde o DG ainda está irreconhecível. Para remover o DG, primeiro isole o hipocampo das fatias. Reconcentre o microscópio para visualizar as bordas ao redor do DG. Dissecar a porção DG através da realização de um corte entre a região dg e CA1 seguido de um corte vertical entre a região DG e CA3 utilizando fórceps. Remova a fimbria e qualquer tecido adjacente.NOTA: Em animais P1-3, o DG é quase indistinguível do chifre de Ammon, mas exibe uma pequena ponta. Coletar o tecido dissecado em um tubo de amostra contendo soluções hbss suplementadas previamente identificadas como DG.NOTA: A lesão geral no hipocampo ou na área circundante tornará mais difícil isolar o DG. O uso de um atlas do cérebro do rato pós-natal é essencial quando o usuário não está familiarizado com o isolamento do tecido SVZ e DG das seções coronais. 3. Dissociação tecidual Para dissociar o tecido SVZ e DG presente em seus respectivos tubos, adicione trypsin-EDTA 0,05% para ter uma concentração final de 5-10% de Trypsin-EDTA 0,05% no HBSS. Incubar por aproximadamente 15 min a 37 °C, até que o tecido esteja agrupado. Lave o tecido da tripsina removendo a mídia e adicionando 1 mL de nova solução suplementada de HBSS por 4 vezes consecutivas. Remova o HBSS e resuspenda o tecido digerido em 1 mL de SFM suplementado com 10 ng/mL EGF e 5 ng/mL bFGF. Dissociar mecanicamente a pelota, encanando suavemente para cima e para baixo aproximadamente 7-10x usando uma pipeta P1000, até obter uma solução celular homogênea.ATENÇÃO: A dissociação mecânica excessiva pode levar ao aumento da morte celular e impactar negativamente o crescimento celular subseqüente. 4. Ensaio de par de células para estudar o destino celular Antes do experimento, prepare placas revestidas de 24 poços para culturas de monocamada aderentes de acordo com as seções 8-10. Para contar o número de células SVZ ou DG (obtidas na seção 3) a serem banhadas, utilize uma solução contendo 0,2% de trypan azul e conte as células usando um hematocitometro. Diluir a suspensão celular dissociada em SFM suplementada com 5 ng/mL EGF e 2,5 ng/mL bFGF (baixo EGF/bFGF) a uma densidade de 11.300 células/cm2 e emplaca-las em tampas de vidro revestidas. Após 24 h, fixe as células para imunocitoquímica contra marcadores NSC, como a região de determinação sexual Y-box 2 (Sox2) e nestin, bem como com um marcador da linhagem neuronal (ou seja, doublecortin [DCX], para neurônios imaturos) (ver seção 14).NOTA: Sox2 é um marcador de NSCs que sofrem mitose. Os pares de células Sox2+/+ resultantes de uma única divisão de células progenitoras refletem a expansão das células-tronco7. 5. Expansão das células-tronco neurais pós-natal como neuroesferas Para determinar a densidade da suspensão de células SVZ ou DG dissociada (obtida na seção 3), conte as células usando um hematocitometro. Diluir a suspensão celular única SVZ e DG a uma densidade de 2 x 104 células/mL em SFM complementada com 10 ng/mL EGF e 5 ng/mL bFGF. Sementes SVZ e Células DG em placas de Petri de 60 mm não revestidas com um volume final de 5 mL/placa de Petri. Incubar células SVZ e DG durante 6-8 dias e 10-12 dias, respectivamente para formar neuroesferas primárias, a 37 °C com 5% de CO2.NOTA: Dias de incubação mais do que os mencionados podem promover a agregação de neuroesferas e níveis mais elevados de morte celular no centro da neurosfera. Quando a maioria das neuroesferas tem um diâmetro de 150-200 μm, realiza a passagem da neurosfera.NOTA: Passar neuroesferas quando não têm um diâmetro adequado compromete todos os próximos passos. 6. Passaging de neuroesferas NOTA: O protocolo a seguir pode ser aplicado para expandir as neuroesferas SVZ e DG. Para passar as neuroesferas, colete o SFM com fatores de crescimento contendo neuroesferas da placa de Petri(es) de 60 mm e centrífugas por 5 min a 300 x g. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota da neurosfera usando um kit de dissociação química (mouse) de acordo com as instruções do fabricante(Tabela de Materiais).NOTA: Observe os tempos de incubação precisamente, pois eles são cruciais para o desempenho. Centrifugagem para 5 min a 300 x g, remova o sobrenadante e adicione 1 mL de SFM complementado com 10 ng/mL EGF e 5 ng/mL bFGF. Triturar para cima e para baixo aproximadamente 10x com uma pipeta P1000 para dissociar as neuroesferas. Conte o número de células usando uma solução contendo 0,2% trypan azul e hematocitometro. Células de reseed a uma densidade de 2 x 104 células/mL em placas de Petri de 60 mm não revestidas. Incubar células SVZ e DG durante 6-8 dias e 10-12 dias, respectivamente para obter neuroesferas secundárias, a 37 °C com 5% de CO2.NOTA: A capacidade de auto-renovação dos NSPCs derivados de SVZ e DG pode ser acessada seguindo as seções de protocolo 5 e 6. Para isso, as células SVZ e DG de sementes a uma densidade de 1,0 x 104 células/mL (em placas de 24 poços não revestidas) em meio SFM de crescimento contendo 5 ng/mL EGF e 2,5 ng/mL bFGF (baixo EGF/bFGF). Conte o número de neuroesferas primárias e secundárias resultantes. 7. Armazenamento de neuroesferas Recolher o meio contendo neuroesferas (obtidas das etapas 5.3 e 6.7) das placas de Petri de 60 mm. Centrifugação por 5 min a 300 x g e descarte o sobrenadante. Lave as células 2x com 1 mL de HBSS (5 min a 300 x g). Centrífuga por 5 min a 300 x g,descarte o sobrenadante e armazene a pelota das neuroesferas a -20 °C para análise de biologia molecular. 8. Procedimento da placa de revestimento PDL Para preparar a solução 1 (tampão borato de 0,1 M), pesar 3,92 g de ácido bórico e diluir em 400 mL de água de alta pureza. Ajuste o pH para 8,2 e faça até 500 mL com água de alta pureza. Para preparar a solução 2 (tampão borato de 0,167 M), pesar 10,3 g de ácido bórico e diluir em 900 mL de água de alta pureza. Ajuste o pH para 8,2 e faça até 1.000 mL com água de alta pureza. Para reconstituir a poli-D-lisina (PDL) (1 mg/mL em tampão de borato de 0,1 M), diluir 100 mg de PDL em 100 mL da solução 1. Faça alíquotas de 10 mL para usar imediatamente ou congele e armazene a -20 °C. Sob o fluxo laminar, adicione 1 deslizamento de cobertura por poço e esterilize sob luz UV por 15 min. Use o PDL reconstituído ou descongele o PDL congelado reconstituído. Prepare a solução final de 100 μg/mL PDL em buffer de borato de 0,167 M adicionando 10 mL de PDL reconstituído a 90 mL da solução 2. Adicione a solução final aos poços para uma mínima de 2h a 37 °C.NOTA: Para placas de 24 poços, adicione um volume de 500 μL em cada poço. Remova a solução e lave 3x com água de alta pureza. Deixe as tampas secarem na capa de fluxo laminar. Deixe as placas de cultura de vários poços a 4 °C. 9. Procedimento da placa de revestimento PDL/Laminin No dia 1º, revestir as placas com PDL conforme descrito na seção 8. No dia 2, retire a solução PDL e lave 3x com água de alta pureza. Deixe secar. Prepare 5 μg/mL de lamina em SFM frio desprovido de fatores de crescimento. Adicione lamina dissolveda às tampas e incubar a 37 °C durante a noite.NOTA: Para placas de 24 poços, adicione um volume de 500 μL em cada poço. Remova a lamina usando uma pipeta.NOTA: Não lave as tampas da lamina. Use imediatamente ou armazene a -20 °C. 10. Procedimento de revestimento poli-L-ornithine (OLP) /lamin Sob o fluxo laminar, adicione um deslizamento de cobertura por poço e esterilize sob luz UV por 15 min. Adicione 0,01% de solução de PLO a cada poço por 20 min à temperatura ambiente (RT).NOTA: Para placas de 24 poços, adicione um volume de 500 μL em cada poço. Remova a solução e lave 3x com 1x PBS esterilizado. Deixe secar. Prepare 5 μg/mL de lamina em 1x PBS estéril. Incubar por 2h a 37 °C. Remova a lamina.NOTA: Não lave as tampas da lamina. Use imediatamente.NOTA: Certifique-se de que o deslizamento de cobertura está totalmente coberto pela solução PLO tocando suavemente no deslizamento de cobertura com uma ponta de pipeta. Quando abalados, as placas de vários poços não devem fazer nenhum som. 11. Avaliação da neuritogênese gerando uma monocamada diferenciada de células Coletar mídias contendo neuroesferas de placas de Petri de 60 mm (obtidas da seção 5) e centrífugas por 5 min a 300 x g no RT. Descarte o sobrenadante e dissocie a pelota das neuroesferas em 1 mL de PBS dissociação (ou seja, PBS sem Mg2+/Ca2+ e com EDTA [2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4 e 0,5 mM EDTA 4Na, no pH = 7,40]) incubando por 15 min seguido de dissociação mecânica. Alternativamente, dissociar as neuroesferas usando um kit de dissociação química (mouse) (Tabela de Materiais). Centrifugação por 5 min a 300 x g no RT e descarte o sobrenadante. Resuspender a pelota celular em 1 mL de SFM desprovido de fatores de crescimento. Determine a densidade celular usando um hematocitometro. Diluir a suspensão celular dissociada em SFM desprovida de fatores de crescimento a uma densidade de 3.766 células/cm2 e células de placa em tampas de vidro revestidas em placas de 24 poços. Após 1-3 dias, fixar células para imunocitoquímica contra uma proteína do citoesqueleto (ver seção 14). 12. Diferenciação das culturas da neurosfera NOTA: As neuroesferas obtidas a partir da expansão celular, seja das neuroesferas primárias ou passageiras (obtidas nas seções 5 ou 6) podem ser diferenciadas em células de diferentes linhagens neurais. Quando as neuroesferas têm um diâmetro de 150-200 μm, coletar 25 μL de meio de suspensão neurosfera e placa em tampas de vidro revestidas, em placas de 24 poços.NOTA: Para coletar mais neuroesferas, gire suavemente a placa de Petri para concentrar as neuroesferas no centro. Então, pipeta do centro. Coloque as placas em uma incubadora a 37 °C por 15 minutos para que as neuroesferas aderam ao substrato. Posteriormente, adicione 500 μL de SFM desprovidos de fatores de crescimento (condições diferenciais). Após 24 h, substitua o meio por SFM fresco desprovido de fatores de crescimento. Diferencie-se para diferentes pontos de tempo (por exemplo, 2 e 7 dias in vitro, DIV2 e DIV7, respectivamente) com 5% de CO2 e 95% de ar atmosférico a 37 °C.NOTA: A sobrevivência celular, a proliferação e a diferenciação podem ser analisadas por meio de diferentes ensaios celulares. 13. Ensaios de biologia celular Ensaio de sobrevivência celular Exponha as neuroesferas banhadas a 3 μg/mL de iodeto de propidium (PI) por 30 min antes da fixação celular na incubadora a 37 °C.NOTA: Pi é um agente autofluorescente que só é capaz de entrar em células com integridade da membrana comprometida8. Outros métodos para analisar a sobrevivência celular podem ser usados, como a coloração de caspase 3 ou o ensaio de rotulagem de desoxiextracleotidyl dUTP (TUNEL). Ensaio de proliferação celular Exponha as neuroesferas banhadas a 10 μM 5-bromo-2′-deoxyuridina (BrdU) por 4 h antes da fixação na incubadora a 37 °C.NOTA: BrdU é um análogo de timmidina sintético que pode ser incorporado durante a síntese de DNA em célulasproliferadoras 9. Ensaio de diferenciação celular Expor as neuroesferas banhadas de 7 dias a 10 μM de BrdU nas primeiras 24 horas, na incubadora a 37 °C. Renovar o SFM desprovido de fatores de crescimento (condições diferenciais) e permitir que as células se desenvolvam na ausência de BrdU pelos 6 dias seguintes até a fixação.NOTA: Esses experimentos de perseguição de pulso, por co-rotulagem com marcadores de células neurais maduras, permitem a avaliação de células progenitoras que se diferenciam em células maduras durante o protocolo. 14. Imunocoloração das culturas da neurosfera Fixação celular Prepare 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x PBS e armazene a 4 °C ou -20 °C. Remova o SFM desprovido de fatores de crescimento de poços e adicione, a cada poço, 500 μL de 4% de PFA a 4 °C por 20 min em RT. Lave 3x com 1x PBS, por 5 min cada vez, as tampas contendo neuroesferas diferenciadas. Guarde as tampas até usar em 500 μL de 1x PBS a 4 °C.NOTA: Se o experimento não tiver BrdU, pule para o passo 14.3. Método de desnaturação (apenas para experimentos de BrdU) Prepare 1 M HCl a 37 °C. Enxágüe tampas 3x em 1x PBS. Células permeabilizadas por 30 min em PBS contendo surfactante nonionico de 1% (por exemplo, Triton X-100). Denatureza dsDNA com 1 M HCl pré-aquecido a 37 °C para 30-40 min a 37 °C (~300 μL/poço). Lave poços 4x com 1x PBS. Permeabilização e bloqueio Enxágüe as tampas em 1x PBS por 5 min. Incubar por 1,5 h com surfactante de 0,5% e 3% de albumina de soro bovino (BSA) em 1x PBS (~300 μL/bem).NOTA: Para NeuN, use 6% de BSA em 1x PBS. Incubação e montagem No primeiro dia, sem lavagem, incubam células com anticorpos primários(Tabela de Materiais)em surfactante de 0,1% e 0,3% bsa em 1x PBS na câmara de incubação (para placas de 24 poços usam 20 μL/poço). Deixe as tampas incubando durante a noite a 4 °C de luz protegida se os anticorpos forem conjugados a um fluoróforo. No dia 2, retorne as coberturas para seus respectivos poços e enxágue 3x em 1x PBS por 5 min. Contra-mancha com fluorescência adequada de anticorpos secundários conjugados (diluição 1:200) e com 12 μg/mL Hoechst 33342 em 1x PBS para 2 h em RT e luz protegida na câmara de incubação (20 μL/enversão). Lavar tampas 3x em 1x PBS por 5 min. Montagem de tampas em lâminas de microscópio usando 5 μL /deslizamento de cobertura do meio de montagem de fluorescência. Deixe as tampas secarem ao ar em RT, protegidos da luz, por 1 dia. Microscopia Visualize e adquira imagens usando um microscópio de fluorescência. Para cada condição, use três réplicas. Realizar contagem de células em cinco campos microscópicos independentes em cada deslizamento de cobertura com um objetivo de 40x (~100 células por campo). 15. Preparação das soluções de estoque EGF e bFGF Solução de ações da EGF Para reconstituir o EGF liofilizado, diluir o produto em água de alta pureza para atingir uma concentração final de 20 μg/mL. Alíquota e armazene em microtubos a -5 a -20 °C. solução de ações bFGFNOTA: bFGF deve ser reconstituído com uma solução de 10 mM Tris, pH 7.6. Centrifugue o frasco brevemente antes de abrir para levar o conteúdo para o fundo. Prepare 50 mL de 10 mM Tris, pH 7.6. Para isso, pesar 60,57 mg de Tris ((HOCH2)3CNH2) e diluí-lo em 40 mL de água de alta pureza. Ajuste o pH para 7,6 e faça até 50 mL com água de alta pureza. Preparar 10 mL de 0,1% BSA em 10 mM Tris, pH 7.6. Para isso, pesar 10 mg de BSA e diluí-lo em 10 mL de 10 mM Tris. Soluções de filtro preparadas nas etapas 15.2.2 e 15.2.3 com um filtro de 0,22 μm sob uma capa de fluxo laminar. Reconstituir 10 μg de bFGF em 1.000 μL de 0,1% BSA em 10 mM Tris com pH 7.6 para atingir uma concentração final de 10 μg/mL. Alíquota em microtubos a -20 °C para um máximo de 6 meses.