Isolamento ed espansione delle neurosfere dalle nicchie neurogeniche del topo postnatali (P1-3)

Tutti gli esperimenti sono stati effettuati in conformità con la legislazione della Comunità europea (86/609/CEE; 2010/63/EU; 2012/707/EU) e portoghese (DL 113/2013) per la protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. Il protocollo è stato approvato dall'”IMM’s institutional Animal Welfare Body – ORBEA-iMM and the National competent authority – DGAV (Direcèo Geral de Atoria e Veterin’ria)” 1. Configurazione di base e preparazione del mezzo di coltura Il giorno della dissezione, preparare la quantità appropriata di mezzo di crescita corrispondente al mezzo senza siero (SFM) composto da Dulbecco modificato aquila medio [(DMEM)/F12 con L-glutamine] (Tabella dei materiali) integrato con 100 U/mL penicillina e 100 g/mL streptomycin (1% Btrep), 1% B27, con anche 10 ng/mL EGF e 5 ng/mL bFGF. Riscaldare il mezzo di coltura a 37 gradi centigradi in un bagno d’acqua.NOTA: Il volume del mezzo di crescita dipende dal numero di cuccioli, per 5 cuccioli preparare 100 mL (50 mL per SV e 50 mL per la DG); tuttavia, dopo aver contato il numero di celle (passaggio 5.1) il volume esatto dovrà essere regolato. Per la microdisezione di SV e DG, preparare il mezzo di dissezione bilanciato (HBSS) di calcio e magnesio (HBSS) integrato con 100 U/mL pen/strep.NOTA: Preparare i 50-100 mL del mezzo di dissezione. Impostare un microscopio di dissezione e preparare gli strumenti necessari per rimuovere il cervello (forbici e piccole spatole) e per le microdissezioni SV e DG (Dumont piccole forbici, #7 pinze, #5 pinze, #5S pinze) immergendosi nel 70% di etanolo. 2. Raccolta di cervelli di topo postnatali (P1-3) e microdisezioni sV/DG Preparare piatti Petri da 60 mm (area di crescita 21 cm2)con HBSS integrati con penna/strepe e 2 tubi campione (uno per SV e uno per la DG) con 500 gradi l di HBSS integrati ciascuno. Eutanasia topi cuccioli (P1-3) secondo il protocollo approvato dalla struttura/linee guida di Institutional Animal Care. Eseguire la decapitazione con una singola incisione con forbici affilate alla base del tronco encefalico. Tenendo la parte ventrale del corpo alla base della testa e usando piccole forbici appuntite, fare un’incisione mediana nella pelle su tutta la lunghezza della testa, rivelando così la superficie del cranio. Fare un’incisione longitudinale alla base del cranio e continuare a tagliare lungo la sutura sagittale utilizzando piccole forbici con un angolo poco profondo possibile al fine di evitare di danneggiare le strutture cerebrali. Sbucciare il cranio ai lati con pinze curve ed esporre il cervello.AVVISO: Assicurarsi che gli strumenti di dissezione siano privi di etanolo prima di toccare il cervello. Isolare il cervello dal cranio utilizzando una piccola spatola, scivolando sotto la base del cervello per tagliare i nervi cranici e vasi sanguigni che sono collegati alla base del cervello, e trasferire il cervello in una piastra Petri contenente fredda completata soluzione HBSS. Posizionare il piatto Petri contenente il cervello sotto un microscopio sezionato a bassa ingrandimento e posizionare il cervello sulla sua superficie dorsale. Utilizzando pinze sottili, rimuovere le meningi dal lato ventrale del cervello e i bulbi olfattivi, tenendo il cervello in posizione dal cervelletto. Ruotare il cervello sull’aspetto ventrale e staccare il resto delle meningi.NOTA: Rimuovere le meningi dorsali è un passo cruciale per garantire il corretto taglio del cervello. Scartare il cervelletto facendo un taglio con pinze. Posizionare una carta da filtro con una dimensione dei pori di 11 m su un elicottero di tessuto (Tabella dei materiali) e impostare il cervello sulla carta da filtro utilizzando pinze a punta curva. Tritare il cervello in 450 sezioni coronale m e utilizzare una lamina bagnata per raccogliere il cervello sezionato in un nuovo piatto Petri pieno di HBSS integrato a freddo. Per sezionare la SVi, utilizzare le pinze per separare le fette coronali in modo anteriore-posteriore fino a raggiungere le fette con i ventricoli laterali, sotto un microscopio sezionante. Tagliare il sottile strato di tessuto che circonda la parete laterale dei ventricoli (che corrisponde alla SV) con pinze sottili, escludendo il parenchyma striato e il corpo calloso. Isolare la punta delle pinze negli angoli laterali del ventricolo laterale: una immediatamente sotto il corpo calloso e l’altro nel tessuto immediatamente adiacente alla zona ventrale del ventricolo laterale. Quindi, tagliare una piccola linea di tessuto che circonda il ventricolo laterale. Raccogliere il tessuto sezionato in un tubo campione con soluzione HBSS integrata precedentemente identificata come SV.NOTA: Escludere l’SV in fette in cui iniziano a comparire sia i ventricoli laterali che la formazione dell’ippocampo. Passare attraverso tutte le fette dopo microdissection SV in una moda anteriore-posteriore e raggiungere la formazione ippocampale. L’uso di pinze elimina la prima fetta con l’ippocampo dove la DG è ancora irriconoscibile. Per rimuovere la DG, prima isolare l’ippocampo dalle fette. Rifocalizzare il microscopio per visualizzare i bordi intorno alla DG. Dissezionare la parte DG eseguendo un taglio tra la DG e la regione CA1 seguito da un taglio verticale tra la DG e la regione CA3 utilizzando le pinze. Rimuovere la fimbria e qualsiasi tessuto adiacente.NOTA: Negli animali P1/3, la DG è quasi indistinguibile dal corno di Ammon, ma mostra una piccola mancia. Raccogliere il tessuto sezionato in un tubo campione contenente soluzioni HBSS integrate precedentemente identificate come DG.NOTA: Le lesioni complessive all’ippocampo o all’area circostante renderanno più difficile isolare la DG. Utilizzando un atlante del cervello del topo postnatale è essenziale quando l’utente non ha familiarità con l’isolamento del tessuto SV e DG dalle sezioni coronali. 3. Dissociazione dei tessuti Per dissociare il tessuto SV e DG presente nei rispettivi tubi, aggiungere trypsin-EDTA 0.05% per avere una concentrazione finale di 5-10% di Trypsin-EDTA 0.05% in HBSS. Incubare per circa 15 min a 37 s, fino a quando il tessuto è aggregato insieme. Lavare il tessuto dalla trippsina rimuovendo il supporto e aggiungendo 1 mL di nuova soluzione integrata HBSS per 4 volte consecutive. Rimuovere l’HBSS e risospendere il tessuto digerito in 1 mL di SFM integrato con 10 ng/mL EGF e 5 ng/mL bFGF. Dissociare meccanicamente il pellet pipet con il tubo dolcesu e giù di circa 7-10 volte utilizzando una pipetta P1000, fino a ottenere una soluzione cellulare omogenea.PRUDENTE: Un’eccessiva dissociazione meccanica può portare ad un aumento della morte cellulare e avrà un impatto negativo sulla successiva crescita cellulare. 4. Saggio di coppia di cellule per studiare il destino delle cellule Prima dell’esperimento, preparare piastre rivestite 24 pozze per le colture motrice aderenti secondo le sezioni 8-10. Per contare il numero di cellule SV o DG (ottenute nella sezione 3) da placcare, utilizzare una soluzione contenente 0,2% Trypan blu e contare le celle utilizzando un ematocitometro. Diluire la sospensione cellulare dissociata in SFM integrata con 5 ng/mL EGF e 2,5 ng/mL bFGF (eGFF basso/bFGF) ad una densità di 11.300 celle/cm2 e lastra su riccioli di vetro rivestiti. Dopo 24 h, fissare le cellule per l’immunocitochimica contro i marcatori NSC come la regione di determinazione del sesso Y-box 2 (Sox2) e nestin, nonché con un marcatore del lignaggio neuronale (vale a dire doublecortin [DCX], per i neuroni immaturi) (vedi sezione 14).NOTA: Sox2 è un marcatore di NSC che subiscono la mitosi. Le coppie di cellule Sox2e / z risultanti da una singola divisione cellulare progenitore riflettono l’espansione delle cellule staminali7. 5. Espansione delle cellule staminali neurali postnatali come neurosfere Per determinare la densità delle sospensioni delle cellule SV o DG dissociate (ottenute nella sezione 3), contare le cellule utilizzando un ematocitometro. Diluire la sospensione a cella singola SV e DG ad una densità di 2 x 104 celle/mL in SFM integrata con 10 ng/mL EGF e 5 ng/mL bFGF. Cellule di semi E DG in piatti Petri da 60 mm non rivestiti con un volume finale di 5 mL/Petri. Incubare le cellule SV e DG per 6-8 giorni e 10-12 giorni, rispettivamente per formare le neurosfere primarie, a 37 sC con 5% CO2.NOTA: I giorni di incubazione più di quelli menzionati possono promuovere l’aggregazione delle neurosfere e livelli più elevati di morte cellulare al centro della neurosfera. Quando la maggior parte delle neurosfere ha un diametro di 150-200 m, eseguire il passaggio della neurosfera.NOTA: Passaging neurosspheres quando non hanno un diametro appropriato compromette tutti i prossimi passi. 6. Passaggio delle neurosfere NOTA: Il seguente protocollo può essere applicato per espandere le neurosfere SV e DG. Per passare le neurosfere, raccogliere la SFM con fattori di crescita contenenti neurosfere dalle parabole di Petri da 60 mm e centrifugare per 5 min a 300 x g. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet della neurosfera utilizzando un kit di dissociazione chimico (mouse) secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).NOTA: Osservare i tempi di incubazione esattamente come sono cruciali per le prestazioni. Centrifuga per 5 min a 300 x g, rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL di SFM integrato con 10 ng/mL EGF e 5 ng/mL bFGF. Triturare su e giù circa 10x con una pipetta P1000 per dissociare le neurosfere. Contare il numero di cellule utilizzando una soluzione contenente 0.2% Trypan blu e un ematocitometro. Cellule reseeding ad una densità di 2 x 104 cellule / mL in piatti Petri da 60 mm non rivestiti. Incubare le cellule SV e DG rispettivamente per 6,8 giorni e 10-12 giorni, per ottenere neurosfere secondarie, a 37 sC con 5% di CO2.NOTA: la capacità di auto-rinnovamento dei NSPC basati su SV e DG è accessibile seguendo le sezioni di protocollo 5 e 6. Per questo, seme sV e DG cellule ad una densità di 1,0 x 104 cellule / mL (in piastre 24-pozze di crescita) in crescita Mezzo SFM contenente 5 ng/mL EGF e 2.5 ng/mL bFGF (basso EGF/bFGF). Contare il numero di neurosfere primarie e secondarie risultanti. 7. Stoccaggio di neurosfere Raccogliere il mezzo contenente neurosfere (ottenuto da gradini 5.3 e 6.7) dai piatti Petri da 60 mm. Centrifuga per 5 min a 300 x g e scartare il supernatante. Lavare le cellule 2x con 1 mL di HBSS (5 min a 300 x g). Centrifuga per 5 min a 300 x g, scartare il supernatale e conservare il pellet delle neurosfere a -20 gradi centigradi per l’analisi della biologia molecolare. 8. Procedura di piastra di rivestimento PDL Per preparare la soluzione 1 (0,1 M tampone di ricambio), pesare 3,92 g di acido borico e diluire in 400 mL di acqua ad alta purezza. Regolare il pH a 8,2 e fare fino a 500 mL con acqua ad alta purezza. Per preparare la soluzione 2 (0,167 M tampone di ricambio), pesare 10,3 g di acido borico e diluire in 900 mL di acqua ad alta purezza. Regolare il pH a 8,2 e fare fino a 1.000 mL con acqua ad alta purezza. Per ricostituire la poli-D-lysine (PDL) (1 mg/mL in buffer di riapunto da 0,1 M), diluire 100 mg di PDL in 100 mL della soluzione 1. Fare aliquote da 10 mL da utilizzare immediatamente o congelare e conservare a -20 gradi centigradi. Sotto il flusso laminare, aggiungere 1 coverslip per bene e sterilizzare sotto la luce UV per 15 min. Utilizzare il PDL ricostituito o scongelato ricostituito PDL. Preparare la soluzione finale di 100 g/mL PDL in buffer di ritassio da 0,167 M aggiungendo 10 mL di PDL ricostituito a 90 mL della soluzione 2. Aggiungere la soluzione finale ai pozze per un minimo di 2 h per una notte a 37 gradi centigradi.NOTA: Per piastre 24 pozzetto, aggiungere un volume di 500 l in ogni pozzo. Rimuovere la soluzione e lavare 3x con acqua ad alta purezza. Lasciare asciugare i coperchi nel cofano a flusso laminare. Lasciare le piastre di coltura multi-bene a 4 gradi centigradi. 9. Procedura di piastrina PDL/Laminin Il primo giorno ricoprire le targhe con PDL come descritto nella sezione 8. Il giorno 2, rimuovere la soluzione PDL e lavare 3x con acqua ad alta purezza. Lasciate asciugare. Preparare 5 laminin a freddo SFM privo di fattori di crescita. Aggiungere laminina disciolta ai coperchii e incubare a 37 gradi durante la notte.NOTA: Per piastre 24 pozzetto, aggiungere un volume di 500 l in ogni pozzo. Rimuovere lalaminina con una pipetta.NOTA: Non lavare i copricopertine dalla laminina. Utilizzare immediatamente o conservare a -20 gradi centigradi. 10. Procedura di rivestimento Poly-L-ornithine (PLO) /laminin Sotto il flusso laminare, aggiungere un coverslip per bene e sterilizzare sotto la luce UV per 15 min. Aggiungere 0,01% soluzione LLO ad ogni pozzo per 20 min a temperatura ambiente (RT).NOTA: Per piastre 24 pozzetto, aggiungere un volume di 500 l in ogni pozzo. Rimuovere la soluzione e lavare 3x con 1x PBS sterilizzato. Lasciate asciugare. Preparare 5 lamin in lamin in sterile 1x PBS. Incubare per 2 h a 37 . Rimuovere laminina.NOTA: Non lavare i copricopertine dalla laminina. Utilizzare immediatamente.NOTA: Assicurarsi che il coperchio sia completamente coperto dalla soluzione PLO toccando delicatamente il coperchio con una punta di pipetta. Quando scosse, le piastre multi-bene non dovrebbero emettere alcun suono. 11. Valutazione della neuritogenesi generando un monostrato differenziato di cellule Raccogliere i supporti contenenti neurosfere da 60 mm piatti Petri (ottenuti dalla sezione 5) e centrifugare per 5 min a 300 x g a RT. Scartare il supernatante e dissociare il pellet delle neurosfere in 1 mL di PBS di dissociazione (cioè, PBS senza Mg2/ Ca2 e con EDTA [2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4 e 0,5 mM EDTA 4Na, a pH 7,40]) incubando per 15 min seguito da dissociazione meccanica. In alternativa, dissociare le neurosfere utilizzando un kit di dissociazione chimica (mouse) (Tabella dei materiali). Centrifuga per 5 min a 300 x g a RT e scartare il supernatante. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di SFM privo di fattori di crescita. Determinare la densità cellulare utilizzando un ematocitometro. Diluire la sospensione cellulare dissociata in SFM priva di fattori di crescita ad una densità di 3.766 cellule /cm2 e le cellule della piastra su coperture in vetro rivestito in piastre di 24 pozzetti. Dopo 1/3 giorni, fissa le cellule per l’immunocitochimica contro una proteina del citoscheletro (vedi sezione 14). 12. Differenziazione delle culture della neurosfera NOTA: Le neurosfere ottenute dall’espansione cellulare, da neurosfere primarie o di passaggio (ottenute nelle sezioni 5 o 6) possono essere differenziate in cellule da diverse linee neurali. Quando le neurosfere hanno un diametro di 150-200 m, raccogliere 25 L di mezzo sospensione della neurosfera e piastra su coperture in vetro rivestito, in 24 piani.NOTA: Per raccogliere più neurosfere, ruotare delicatamente il piatto Petri per concentrare le neurosfere al centro. Poi, pipetta dal centro. Mettere le piastre in un’incubatrice a 37 gradi centigradi per 15 min in modo che le neurosfere aderiscano al substrato. Successivamente, aggiungere 500 l di SFM privo di fattori di crescita (condizioni differenziative). Dopo 24 h, sostituire il mezzo con SFM fresco privo di fattori di crescita. Differenziare per diversi punti temporali (ad es. 2 e 7 giorni in vitro, rispettivamente DIV2 e DIV7) con 5% di CO2 e 95% aria atmosferica a 37 gradi centigradi.NOTA: La sopravvivenza cellulare, la proliferazione e la differenziazione possono essere analizzate utilizzando diversi saggi cellulari. 13. Saggi di biologia cellulare Analisi della sopravvivenza cellulare Esporre le neurosfere placcate a 3 g/mL di ioduro propidio (PI) per 30 min prima della fissazione cellulare nell’incubatrice a 37 gradi centigradi.NOTA: PI è un agente autofluorescente che è solo in grado di entrare cellule con integrità della membrana compromessa8. Altri metodi per analizzare la sopravvivenza delle cellule possono essere utilizzati come la colorazione caspase 3 o il saggio TUNEL (deoxynucleotidyl transferase dUTP) del deoxynucleotidyl. Saggio di proliferazione cellulare Esporre le neurosfere placcate a 10 -M 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdYuridina) per 4 h prima della fissazione nell’incubatrice a 37 gradi centigradi.NOTA: BrdU è un analogo timinoso sintetico che può essere incorporato durante la sintesi del DNA nelle cellule che proliferano9. Saggio di differenziazione cellulare Esporre le neurosfere placcate di 7 giorni a 10 m di BrdU nelle prime 24 h, nell’incubatrice a 37 gradi centigradi. Rinnovare il SFM privo di fattori di crescita (condizioni differenziative) e consentire alle cellule di svilupparsi in assenza di BrdU per i successivi 6 giorni fino alla fissazione.NOTA: Questi esperimenti di inseguimento del polso, mediante la co-etichettatura con marcatori di cellule neurali mature, consentono la valutazione delle cellule progenitrici che si differenziano in cellule mature durante il protocollo. 14. Immunostaining delle culture della neurosfera Fissazione delle celle Preparare il 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x PBS e conservarlo a 4 o -20 gradi centigradi. Togliere la SFM priva di fattori di crescita dai pozze e aggiungere, ad ogni pozzo, 500 -L di 4% PFA a 4 gradi centigradi per 20 min a RT. Lavare 3x con 1x PBS, per 5 min ogni volta, i coprilabbra contenenti neurosfere differenziate. Conservare i coprilabbra fino all’uso in 500 – L di 1x PBS a 4 gradi centigradi.NOTA: se l’esperimento non dispone di BrdU, andare al passaggio 14.3. Metodo di denaturazione (solo per esperimenti BrdU) Preparare 1 M HCl a 37 gradi centigradi. Risciacquare le coverlips 3x in 1x PBS. Permeabilizzare le celle per 30 min in PBS contenenti 1% di sovraffattore nonionico (ad esempio, Triton X-100). Denatura dsDNA con 1 M HCl preriscaldato a 37 gradi centigradi per 30-40 min a 37 gradi centigradi. Lavare i pozzi 4x con 1x PBS. Permeabilizzazione e blocco Risciacquare i coperchi in 1x PBS per 5 min. Incubare per 1,5 h con 0,5% di surfactant nonionico e 3% di albumina di siero bovino (BSA) in 1x PBS (300 dollari l/po).NOTA: per NeuN, utilizzare 6% BSA in 1x PBS. Incubazione e montaggio Il primo giorno, senza lavaggio, incubare le cellule con anticorpi primari (Tabella dei Materiali) in un surfactant nonionico dello 0,1% e nello 0,3% di BSA in 1x PBS nella camera di incubazione (per le lastre di 24 pozze consumo di 20 l/well). Lasciare le coverlips incubazione durante la notte a 4 gradi centigradi se gli anticorpi sono coniugati a un fluoroforo. Il giorno 2, riportare i coperchi ai rispettivi pozzi e risciacquare 3x in 1x PBS per 5 min. Controstain con afluorescenza appropriata coniugato anticorpi secondari (diluizione 1:200) e con 12 g/mL Hoechst 33342 in 1x PBS per 2 h a RT e luce protetta nella camera di incubazione (20 l/coverslip). Lavare i coperchi 3x in 1x PBS per 5 min. Montare i copricapi su vetrini al microscopio utilizzando 5 litri di mezzo di montaggio a fluorescenza. Lasciare che i coperchi all’aria si asciughino a RT, protetto dalla luce, per 1 giorno. Microscopia Visualizzare e acquisire immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza. Per ogni condizione, utilizzare tre repliche. Esegui il conteggio delle cellule in cinque campi microscopici indipendenti in ogni vetrino con un obiettivo 40x (100 celle per campo). 15. Preparazione delle soluzioni azionarie EGF e bFGF Soluzione stock EGF Per ricostituire l’EGF liofilizzato, diluire il prodotto in acqua ad alta purezza per raggiungere una concentrazione finale di 20 g/mL. Aliquota e conservare in microtubi a -5 a -20 gradi centigradi. bFGF soluzione stockNOTA: bFGF deve essere ricostituito con una soluzione di 10 mM Tris, pH 7.6. Centrifugare brevemente la fiala prima di aprirsi per portare il contenuto sul fondo. Preparare 50 mL di 10 mM Tris, pH 7.6. Per questo, pesare 60.57 mg di Tris ((HOCH2)3CNH2) e diluirlo in 40 mL di acqua ad alta purezza. Regolare il pH a 7,6 e fare fino a 50 mL con acqua ad alta purezza. Preparare 10 mL di 0,1% BSA in 10 mM Tris, pH 7.6. Per questo, pesare 10 mg di BSA e diluirlo in 10 mL di 10 mM Tris. Soluzioni di filtro preparate nei passaggi 15.2.2 e 15.2.3 con un filtro di 0,22 m sotto un cappuccio a flusso laminare. Ricostituire 10 g di bFGF in 1.000 .L di 0,1% DI BSA in 10 mM Tris con pH 7,6 per raggiungere una concentrazione finale di 10 g/mL. Aliquota in microtubi a -20 gradi centigradi per un massimo di 6 mesi.