Isolierung und Expansion von Neurosphären aus postnatalen (P1-3) Maus neurogenen Nischen

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Rechtsvorschriften der Europäischen Gemeinschaft (86/609/EWG; 2010/63/EU; 2012/707/EU) und den portugiesischen Rechtsvorschriften (DL 113/2013) zum Schutz von Tieren durchgeführt, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden. Das Protokoll wurde von der institutionellen Tierschutzorganisation des iMM – ORBEA-iMM und der zuständigen nationalen Behörde – DGAV ( Direcéo Geral de Alimentaéo e Veterinii) genehmigt.” 1. Grundeinrichtung und Vorbereitung des Kulturmediums Am Tag der Zerlegung die entsprechende Menge an Wachstumsmedium entsprechend dem serumfreien Medium (SFM) zubereiten, bestehend aus Dulbeccos modifiziertem Adlermedium [(DMEM)/F12 mit L-Glutamin] (Materialtabelle) ergänzt mit 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin (Pen/Strep), 1% B27, mit ebenfalls 10 ng/mL EGF und 5 ng/mL bFGF. Erwärmen Sie das Kulturmedium auf 37 °C im Wasserbad.ANMERKUNG: Das Volumen des Wachstumsmediums hängt von der Anzahl der Welpen ab, für 5 Welpen bereiten 100 ml (50 ml für SVZ und 50 ml für DG); Nach Zählung der Anzahl der Zellen (Schritt 5.1) muss jedoch das genaue Volumen angepasst werden. Für die Mikrodissektion von SVZ und DG, bereiten Sie die Calcium und Magnesium-freie Hanks Ausgewogene Saline-Lösung (HBSS) Dissektion Medium mit 100 U/ml Stift/Strep ergänzt.HINWEIS: Bereiten Sie 50 bis 100 ml Seziermedium vor. Richten Sie ein Seziermikroskop ein und bereiten Sie die Werkzeuge vor, die zum Entfernen des Gehirns (Schere und kleiner Spachtel) und für SVZ- und DG-Mikrodissektionen (Dumont-Kleinschere, #7 Zangen, #5 Zangen, #5S Zangen) benötigt werden, indem Sie 70 % Ethanol einweichen. 2. Ernte von postnatalen (P1-3) Maushirnen und SVZ/DG-Mikrodissektionen Bereiten Sie 60 mm Petrischalen (Wachstumsfläche 21 cm2) mit HBSS ergänzt mit Stift/Strep und 2 Probenröhrchen (eines für SVZ und eines für DG) mit je 500 l ergänzten HBSS zu. Euthanisieren Sie Mäusewelpen (P1-3) gemäß dem von der Institutional Animal Care Facility/Guidelines genehmigten Protokoll. Führen Sie die Enthauptung mit einem einzigen Schnitt mit einer scharfen Schere an der Basis des Hirnstamms durch. Halten Sie den ventralen Teil des Körpers an der Basis des Kopfes und mit kleinen spitzen Scheren, machen Sie einen Mittellinienschnitt in der Haut über die gesamte Länge des Kopfes, so dass die Oberfläche des Schädels offenbaren. Machen Sie einen Längsschnitt an der Schädelbasis und schneiden Sie die sagittale Naht mit einer kleinen Schere mit einem möglichst flachen Winkel entlang, um eine Beschädigung der Gehirnstrukturen zu vermeiden. Schälen Sie den Schädel mit gekrümmten Zangen an den Seiten und belichten Sie das Gehirn.VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass die Sezierenden Instrumente frei von Ethanol sind, bevor Sie das Gehirn berühren. Isolieren Sie das Gehirn aus dem Schädel mit einem kleinen Spachtel, indem Sie unter der Basis des Gehirns gleiten, um die Hirnnerven und Blutgefäße zu schneiden, die mit der Basis des Gehirns verbunden sind, und übertragen Sie das Gehirn in eine Petrischale mit kalt ergänzter HBSS-Lösung. Platzieren Sie die Petrischale mit dem Gehirn unter einem Sezierendes Mikroskop bei geringer Vergrößerung und positionieren Sie das Gehirn auf seiner dorsalen Oberfläche. Mit feinen Zangen, entfernen Sie die Hirnhäuschen von der ventralen Seite des Gehirns und die olfaktorischen Glühbirnen, während Sie das Gehirn in Position durch das Kleinhirn halten. Drehen Sie das Gehirn auf den ventralen Aspekt und schälen Sie den Rest der Hirnhaut ab.HINWEIS: Das Entfernen der dorsalen Meningen ist ein entscheidender Schritt, um eine korrekte Gehirnschnitte zu gewährleisten. Entsorgen Sie das Kleinhirn, das einen Schnitt mit Zangen macht. Legen Sie ein Filterpapier mit einer Porengröße von 11 m auf einen Gewebehäcksler (Materialtabelle) und legen Sie das Gehirn mit gekrümmten Zangen auf das Filterpapier. Schneiden Sie das Gehirn in 450 ‘m koronalen Abschnitte und verwenden Sie eine nasse Lamina, um das geschnittene Gehirn in eine neue Petrischale mit kalt ergänzten HBSS gefüllt zu sammeln. Um die SVZ zu sezieren, verwenden Sie Zangen, um koronale Scheiben in einer vorderen bis posterioren Art und Weise zu trennen, bis Scheiben mit den seitlichen Ventrikeln unter einem Sezierenmikroskop erreicht werden. Schneiden Sie die dünne Gewebeschicht, die die Seitenwand der Ventrikel umgibt (was dem SVZ entspricht), mit feiner Zange, ausgenommen das striatale Parenchym und das Corpus callosum. Isolieren Sie die SVZ, indem Sie die Spitze der Zange in den seitlichen Ecken des seitlichen Ventrikels platzieren: eine unmittelbar unter dem Corpus callosum und die andere in das Gewebe unmittelbar neben dem ventralen Bereich des lateralen Ventrikels. Schneiden Sie dann eine kleine Gewebelinie um den seitlichen Ventrikel. Sammeln Sie das sezierte Gewebe in ein Probenröhrchen mit ergänzter HBSS-Lösung, die zuvor als SVZ identifiziert wurde.HINWEIS: Schließen Sie die SVZ in Scheiben aus, in denen sowohl die seitlichen Ventrikel als auch die Hippocampusbildung zu erscheinen beginnen. Gehen Sie alle Scheiben nach SVZ-Mikrodissektion in einer anterior-zu-posterior Art und Weise und erreichen Sie die Hippocampus-Formation. Mit Zangen verwerfen Sie die erste Scheibe mit Hippocampus, wo DG noch nicht wiederzuerkennen ist. Um die DG zu entfernen, isolieren Sie zuerst den Hippocampus aus den Scheiben. Richten Sie das Mikroskop neu aus, um die Grenzen um DG herum zu visualisieren. Sezieren Sie den DG-Anteil, indem Sie einen Schnitt zwischen der DG- und der CA1-Region durchführen, gefolgt von einem vertikalen Schnitt zwischen der DG- und der CA3-Region mit Zangen. Entfernen Sie Fimbria und jedes angrenzende Gewebe.HINWEIS: Bei Tieren aus P1-3 ist die DG fast nicht von Ammons Horn zu unterscheiden, zeigt aber eine kleine Spitze an. Sammeln Sie das sezierte Gewebe in ein Probenröhrchen mit ergänzten HBSS-Lösungen, die zuvor als DG identifiziert wurden.ANMERKUNG: Eine Gesamtverletzung des Hippocampus oder der Umgebung wird es schwieriger machen, die GD zu isolieren. Die Verwendung eines Atlas des postnatalen Maushirns ist unerlässlich, wenn der Anwender nicht mit der Isolierung des SVZ- und DG-Gewebes aus koronalen Abschnitten vertraut gemacht wird. 3. Gewebedissoziation Um das in ihren jeweiligen Röhrchen vorhandene SVZ- und DG-Gewebe zu dissoziieren, fügen Sie Trypsin-EDTA 0,05 % hinzu, um eine Endkonzentration von 5 bis 10 % Trypsin-EDTA 0,05 % in HBSS zu haben. Etwa 15 min bei 37 °C inkubieren, bis das Gewebe verklumpt ist. Waschen Sie das Gewebe aus dem Trypsin, indem Sie die Medien entfernen und 1 ml neue HBSS-Ergänzungslösung für 4 aufeinander folgende Male hinzufügen. Entfernen Sie die HBSS und setzen Sie das verdaute Gewebe in 1 ml SFM ergänzt mit 10 ng/mL EGF und 5 ng/mL bFGF. Zerlegen Sie das Pellet mechanisch, indem Sie mit einer P1000-Pipette das Pellet vorsichtig auf und ab leiten, bis es eine homogene Zelllösung erhält.VORSICHT: Übermäßige mechanische Dissoziation kann zu einem erhöhten Zelltod führen und sich negativ auf das nachfolgende Zellwachstum auswirken. 4. Zell-Paar-Assay zur Untersuchung des Zellschicksals Bereiten Sie vor dem Experiment beschichtete 24-Well-Platten für anhaftende Monolayer-Kulturen nach den Abschnitten 8-10 vor. Um die Anzahl der zu versiebenenden SVZ- oder DG-Zellen (in Abschnitt 3) zu zählen, verwenden Sie eine Lösung mit 0,2 % Trypanblau und zählen Sie die Zellen mit einem Hämatozytometer. Verdünnen Sie die dissoziierte Zellsuspension in SFM, ergänzt mit 5 ng/mL EGF und 2,5 ng/mL bFGF (niedriges2 EGF/bFGF) bei einer Dichte von 11.300 Zellen/cm2 und verschichten Sie sie auf beschichteten Glasabdeckungen. Fixieren Sie nach 24 h die Zellen für die Immunzytochemie gegen NSC-Marker wie die geschlechtsbestimmende Region Y-Box 2 (Sox2) und Nestin sowie mit einem Marker der neuronalen Abstammung (nämlich Doublecortin [DCX], für unreife Neuronen) (siehe Abschnitt 14).HINWEIS: Sox2 ist ein Marker von NSCs, die einer Mitose unterzogen werden. Sox2+/+ Zellpaare, die aus einer einzelnen Vorläuferzellteilung resultieren, spiegeln die Stammzellexpansion7wider. 5. Expansion postnataler neuronaler Stammzellen als Neurosphären Um die Dichte der dissoziierten SVZ- oder DG-Zellsuspension (in Abschnitt 3 erhalten) zu bestimmen, zählen Sie die Zellen mit einem Hämatozytometer. Verdünnung der Einzelzellsuspension SVZ und DG bei einer Dichte von 2 x 104 Zellen/ml in SFM, ergänzt durch 10 ng/ml EGF und 5 ng/ml bFGF. Samen SVZ- und DG-Zellen in unbeschichteten 60 mm Petrischalen mit einem Endvolumen von 5 ml/Petrischale. Inkubieren Sie SVZ- und DG-Zellen für 6 bis 8 Tage bzw. 10 bis 12 Tage, um primäre Neurosphären bei 37 °C mit 5%CO2zu bilden.HINWEIS: Inkubationstage mehr als die genannten können die Aggregation von Neurosphären und höhere Ebenen des Zelltodes im Zentrum der Neurosphäre fördern. Wenn die Mehrheit der Neurosphären einen Durchmesser von 150 bis 200 m haben, führen Sie die Neurosphärenpassage durch.HINWEIS: Das Passieren von Neurosphären, wenn sie keinen geeigneten Durchmesser haben, beeinträchtigt alle nächsten Schritte. 6. Passierung von Neurosphären HINWEIS: Das folgende Protokoll kann angewendet werden, um sowohl SVZ- als auch DG-Neurosphären zu erweitern. Um Neurosphären zu durchleben, sammeln Sie den SFM mit Wachstumsfaktoren, die Neurosphären aus der 60 mm Petrischale(en) und Zentrifuge für 5 min bei 300 x genthalten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Neurosphärenpellet mit einem chemischen Dissoziationskit (Maus) gemäß den Anweisungen des Herstellers(Materialtabelle) wieder aus.HINWEIS: Beobachten Sie die Inkubationszeiten genau, da sie für die Leistung entscheidend sind. Zentrifuge für 5 min bei 300 x g, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml SFM ergänzt mit 10 ng/mL EGF und 5 ng/mL bFGF. Trituieren Sie etwa 10x mit einer P1000 Pipette auf und ab, um Neurosphären zu dissoziieren. Zählen Sie die Anzahl der Zellen, die eine Lösung mit 0,2% Trypan blau und einem Hämatozytometer enthalten. Reseed-Zellen mit einer Dichte von 2 x 104 Zellen/ml in unbeschichteten 60 mm Petrischalen. Inkubieren Sie SVZ- und DG-Zellen für 6 bis 8 Tage bzw. 10 bis 12 Tage, um sekundäre Neurosphären bei 37 °C mit 5%CO2zu erhalten.HINWEIS: Auf die Selbsterneuerungskapazität von SVZ- und DG-abgeleiteten NSSpCs kann über die folgenden Protokollabschnitte 5 und 6 zugegriffen werden. Dazu saatieren SVZ- und DG-Zellen mit einer Dichte von 1,0 x 104 Zellen/ml (in unbeschichteten 24-Well-Platten) in Wachstums-SFM-Medium mit 5 ng/mL EGF und 2,5 ng/ml bFGF (niedriger EGF/bFGF). Zählen Sie die Anzahl der resultierenden primären und sekundären Neurosphären. 7. Lagerung von Neurosphären Sammeln Sie das Medium, das Neurosphären enthält (aus den Schritten 5.3 und 6.7) aus den 60 mm Petrischalen. Zentrifugieren Sie 5 min bei 300 x g und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen 2x mit 1 ml HBSS (5 min bei 300 x g). Zentrifuge für 5 min bei 300 x g, entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie das Pellet von Neurosphären bei -20 °C für die molekularbiologische Analyse. 8. PDL-Beschichtungsplattenverfahren Zur Herstellung der Lösung 1 (0,1 M Boratpuffer), 3,92 g Borsäure wiegen und in 400 ml hochreinem Wasser verdünnen. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,2 ein und machen Sie bis zu 500 ml mit hochreinem Wasser. Zur Herstellung von Lösung 2 (0,167 M Boratpuffer), 10,3 g Borsäure wiegen und in 900 ml hochreinem Wasser verdünnen. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,2 ein und machen Sie bis zu 1.000 ml mit hochreinem Wasser. Um Poli-D-Lysin (PDL) (1 mg/ml in 0,1 M Boratpuffer) zu rekonstruieren, 100 mg PDL in 100 ml lösung 1 zu verdünnen. Machen Sie Aliquots von 10 ml sofort zu verwenden oder einfrieren und lagern bei -20 °C. Fügen Sie unter dem laminaren Durchfluss 1 Deckschrutsch pro Brunnen hinzu und sterilisieren Sie unter UV-Licht für 15 min. Verwenden Sie die rekonstituierte PDL oder tauen Sie die rekonstituierte PDL. Bereiten Sie die von 100 g/ml PDL in 0,167 M Boratpuffer vor, indem Sie 10 ml rekonstituierte PDL zu 90 ml lösung 2 hinzufügen. Fügen Sie die endgültige Lösung in Brunnen für mindestens 2 h bis über Nacht bei 37 °C.HINWEIS: Für 24-Well-Platten, fügen Sie ein Volumen von 500 l in jedem Brunnen. Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie 3x mit hochreinem Wasser. Lassen Sie die Abdeckungen in der laminaren Fließhaube trocknen. Lassen Sie die Multi-Well-Kulturplatten bei 4 °C. 9. PDL/Laminin Beschichtungsplattenverfahren Beschichten Sie die Platten am ersten Tag mit PDL, wie in Abschnitt 8 beschrieben. Entfernen Sie am 2. Tag die PDL-Lösung und waschen Sie 3x mit hochreinem Wasser. Trocknen lassen. Bereiten Sie 5 g/ml Laminin in kaltem SFM ohne Wachstumsfaktoren vor. Gelöstes Laminin in die Abdeckungen geben und bei 37 °C über Nacht inkubieren.HINWEIS: Für 24-Well-Platten, fügen Sie ein Volumen von 500 l in jedem Brunnen. Laminin mit einer Pipette entfernen.HINWEIS: Waschen Sie die Deckel nicht von Laminin. Sofort verwenden oder bei -20 °C lagern. 10. Poly-L-Ornithin (PLO) /Laminin-Beschichtungsverfahren Fügen Sie unter dem laminaren Durchfluss einen Deckelschlupf pro Brunnen hinzu und sterilisieren Sie unter UV-Licht 15 min. Fügen Sie 0,01% PLO-Lösung zu jedem Brunnen für 20 min bei Raumtemperatur (RT).HINWEIS: Für 24-Well-Platten, fügen Sie ein Volumen von 500 l in jedem Brunnen. Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie 3x mit sterilisiertem 1x PBS. Trocknen lassen. Bereiten Sie 5 g/ml Laminin in sterilem 1x PBS vor. 2 h bei 37 °C inkubieren. Entfernen Sie Laminin.HINWEIS: Waschen Sie die Deckel nicht von Laminin. Sofort verwenden.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Coverslip vollständig von der PLO-Lösung abgedeckt ist, indem Sie vorsichtig mit einer Pipettenspitze auf den Deckelschlupf tippen. Wenn sie geschüttelt werden, sollten die Multi-Well-Platten keinen Ton machen. 11. Bewertung der Neuritogenese durch Erzeugung einer differenzierten Monoschicht der Sammeln Sie Medien mit Neurosphären aus 60 mm Petrischalen (aus Abschnitt 5) und Zentrifuge für 5 min bei 300 x g bei RT. Entsorgen Sie das Überstand und dissoziieren Sie das Pellet der Neurosphären in 1 ml Dissoziation PBS (d. h. PBS ohne Mg2+/Ca2+ und mit EDTA [2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4 und 0,5 mM EDTA 4Na, bei pH = 7,40]) durch Inkubation für 15 min gefolgt von mechanischer Dissoziation. Alternativ können Sie Neurosphären mit einem chemischen Dissoziationskit (Maus) (Materialtabelle )dissoziieren. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 300 x g bei RT und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml SFM ohne Wachstumsfaktoren aus. Bestimmen Sie die Zelldichte mit einem Hämatozytometer. Verdünnen Sie die dissoziierte Zellsuspension in SFM ohne Wachstumsfaktoren bei einer Dichte von 3.766 Zellen/cm2 und Plattenzellen auf beschichteten Glasabdeckungen in 24-Well-Platten. Fixieren Sie nach 1 bis 3 Tagen Zellen für die Immunzytochemie gegen ein Protein des Zytoskeletts (siehe Abschnitt 14). 12. Differenzierung von Neurosphärenkulturen HINWEIS: Neurosphären, die aus der Zellexpansion gewonnen werden, entweder aus primären oder durchdrängenden Neurosphären (in Abschnitt 5 oder 6 erhalten) können in Zellen aus verschiedenen neuronalen Linien unterschieden werden. Wenn Neurosphären einen Durchmesser von 150 bis 200 m haben, sammeln Sie 25 L Neurosphärensuspensionsmedium und Platte auf beschichteten Glasabdeckungen, in 24-Well-Platten.HINWEIS: Um mehr Neurosphären zu sammeln, drehen Sie vorsichtig die Petrischale, um die Neurosphären in der Mitte zu konzentrieren. Dann Pipette aus der Mitte. Legen Sie die Platten 15 min in einen Inkubator bei 37 °C, damit Neurosphären am Substrat haften. Fügen Sie danach 500 L SFM ohne Wachstumsfaktoren hinzu (unterschiedliche Bedingungen). Nach 24 h, ersetzen Sie das Medium durch frische SFM ohne Wachstumsfaktoren. Unterscheiden Sie für verschiedene Zeitpunkte (z. B. 2 bzw. 7 Tage in vitro, DIV2 bzw. DIV7) mit 5%CO2 bzw. 95% atmosphärischer Luft bei 37 °C.HINWEIS: Das Überleben, die Zellproliferation und die Differenzierung können mit verschiedenen Zellassays analysiert werden. 13. Zellbiologie-Assays Zellüberlebenstest Setzen Sie plattierte Neurosphären 30 min Propidiumiodid (PI) 30 min vor der Zellfixierung im Inkubator bei 37 °C aus.HINWEIS: PI ist ein autofluoreszierendes Mittel, das nur in der Lage ist, in Zellen mit beeinträchtigter Membranintegritäteinzudringen 8. Andere Methoden zur Analyse des Zellüberlebens können verwendet werden, wie Caspase-3-Färbung oder der terminale Desoxynukleotidyltransferase dUTP-Nickel-End-Etikettierung (TUNEL) Assay. Zellproliferationstest Plattierte Neurosphären vor der Fixierung im Inkubator bei 37 °C 4 h vor fixieren.HINWEIS: BrdU ist ein synthetisches Thymidin-Analogon, das während der DNA-Synthese in vermehrende Zellen9eingearbeitet werden kann. Zelldifferenzierungstest 7 Tage alte plattierte Neurosphären in den ersten 24 h im Inkubator bei 37 °C auf 10 M BrdU aussetzen. Erneuern Sie den SFM ohne Wachstumsfaktoren (unterschiedliche Bedingungen) und ermöglichen Sie es Zellen, sich in Abwesenheit von BrdU für die folgenden 6 Tage bis zur Fixierung zu entwickeln.HINWEIS: Diese Puls-Chase-Experimente ermöglichen durch Ko-Kennzeichnung mit Markern reifer Nervenzellen die Auswertung von Vorläuferzellen, die sich während des Protokolls in reife Zellen differenzieren. 14. Immunostainierung von Neurosphärenkulturen Zellfixierung 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS vorbereiten und bei 4 °C oder -20 °C lagern. Entfernen Sie den SFM ohne Wachstumsfaktoren aus Denbrunnen und fügen Sie jedem Brunnen 500 l 4% PFA bei 4 °C für 20 min bei RT hinzu. Waschen Sie 3x mit 1x PBS, für 5 min jedes Mal, die Coverlips enthalten differenzierte Neurosphären. Coverlips bis zur Verwendung in 500 l 1x PBS bei 4 °C lagern.HINWEIS: Wenn das Experiment keine BrdU enthält, fahren Sie mit Schritt 14.3 fort. Denaturierungsmethode (nur für BrdU-Experimente) 1 M HCl bei 37 °C vorbereiten. Spülen Sie Abdeckungen 3x in 1x PBS. Permeabilisieren Sie Zellen für 30 min in PBS, die 1% nichtionisches Tensid enthalten (z. B. Triton X-100). Denatur dsDNA mit 1 M HCl vorgewärmt auf 37 °C für 30 x 40 min bei 37 °C (ca. 300 l/well). Waschbrunnen 4x mit 1x PBS waschen. Permeabilisierung und Blockierung Spülen Sie Deckellipsen in 1x PBS für 5 min. Inkubieren Sie für 1,5 h mit 0,5% nichtionischem Tensid und 3% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS (ca. 300 l/well).HINWEIS: Verwenden Sie für NeuN 6% BSA in 1x PBS. Inkubation und Montage Am ersten Tag ohne Waschen, inkubieren Zellen mit primären Antikörpern (Materialtabelle) in 0,1% nichtionischem Tensid und 0,3% BSA in 1x PBS in der Inkubationskammer (für 24-Well-Platten verwenden 20 l/well). Lassen Sie Die lips über Nacht bei 4 °C lichtgeschützt, wenn Antikörper zu einem Fluorophor konjugiert werden. Am 2. Tag, Rückdeckungslips zu ihren jeweiligen Brunnen und spülen 3x in 1x PBS für 5 min. Gegenfärbung mit geeigneten fluoreszenzkonjugierten Sekundärantikörpern (Verdünnung 1:200) und mit 12 g/ml Hoechst 33342 in 1x PBS für 2 h bei RT und Licht geschützt in der Inkubationskammer (20 l/Coverslip). Waschen Sie Abdeckungen 3x in 1x PBS für 5 min. Montieren Sie Abdeckungen auf Mikroskopschlitten mit 5 l/Coverslip von Fluoreszenz-Montagemedium. Lassen Sie die Abdeckungen bei RT, vor Licht geschützt, 1 Tag lang trocknen. Mikroskopie Anzeigen und Erfassen von Bildern mit einem Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie für jede Bedingung drei Replikationen. Führen Sie die Zellzahl in fünf unabhängigen mikroskopischen Feldern in jedem Deckslip mit einem 40-fachen Objektiv (ca. 100 Zellen pro Feld) aus. 15. Erstellung von EGF- und bFGF-Aktienlösungen EGF-Aktienlösung Um den lyophilisierten EGF zu rekonstituieren, verdünnen Sie das Produkt in hochreinem Wasser, um eine Endkonzentration von 20 g/ml zu erreichen. Aliquot und lagern in Mikroröhren bei -5 bis -20 °C. bFGF AktienlösungHINWEIS: bFGF muss mit einer Lösung von 10 mM Tris, pH 7,6, rekonstituiert werden. Zentrifugieren Sie die Durchstechflasche kurz vor dem Öffnen, um den Inhalt auf den Boden zu bringen. Bereiten Sie 50 ml von 10 mM Tris, pH 7,6 vor. Wiegen Sie dafür 60,57 mg Tris ((HOCH2)3CNH2) und verdünnen Sie es in 40 ml hochreinem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,6 ein und machen Sie bis zu 50 ml mit hochreinem Wasser. Bereiten Sie 10 ml von 0,1% BSA in 10 mM Tris, pH 7,6 vor. Wiegen Sie dazu 10 mg BSA und verdünnen Sie es in 10 ml von 10 ml Tris. Filterlösungen in den Schritten 15.2.2 und 15.2.3 mit einem 0,22 m Filter unter einer laminaren Durchflusshaube. Rekonstituieren Sie 10 g bFGF in 1.000 l von 0,1% BSA in 10 mM Tris mit pH 7,6, um eine Endkonzentration von 10 g/ml zu erreichen. Aliquot in Mikroröhren bei -20 °C für maximal 6 Monate.