Isolement et expansion des neurosphères des niches neurogéniques de souris postnatales (P1-3)

Toutes les expériences ont été réalisées conformément à la Communauté européenne (86/609/CEE; 2010/63/UE; 2012/707/UE) et à la législation portugaise (DL 113/2013) pour la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Le protocole a été approuvé par le “Corps institutionnel de bien-être animal de l’IMM – ORBEA-iMM et l’autorité compétente nationale – DGAV (Direcço Geral de Alimentaçào e Veterinària).” 1. Configuration de base et préparation du milieu de la culture Le jour de la dissection, préparez la quantité appropriée de milieu de croissance correspondant au milieu sans sérum (SFM) composé du milieu aigle modifié de Dulbecco [(DMEM)/F12 avec L-glutamine](Tableau des matériaux) complété par 100 P/ML pénicilline et 100 G/mL streptomycine (pen/sreprep), 1% B27, avec également 10 ng/mL EGF et 5 ng/mL bFGF. Réchauffer la culture à 37 oC dans un bain d’eau.REMARQUE : Le volume de croissance moyenne dépend du nombre de chiots, car 5 chiots préparent 100 ml (50 ml pour SVZ et 50 ml pour la DG); cependant, après avoir compté le nombre de cellules (étape 5.1), le volume exact devra être ajusté. Pour la microdissection de SVZ et DG, préparez le milieu de dissection équilibré de la solution saline équilibrée (HBSS) sans calcium et sans magnésium (HBSS) complété par un stylo/streptocoque de 100 U/mL.REMARQUE : Préparer 50 à 100 ml de milieu de dissection. Installez un microscope à dissection et préparez les outils nécessaires pour enlever le cerveau (ciseaux et petites spatules) et pour les microdissections SVZ et DG (petits ciseaux Dumont, forceps #7, forceps #5, #5S forceps) en trempant dans 70% d’éthanol. 2. Récolte des cerveaux de souris postnatals (P1-3) et des microdissections SVZ/DG Préparer des plats Petri de 60 mm (zone de croissance 21 cm2) avec HBSS complétés par un stylo/streptococcie et 2 tubes d’échantillon (un pour SVZ et un pour la DG) avec 500 L de HBSS complété chacun. Euthanasier les chiots souris (P1-3) selon le protocole approuvé par l’établissement de soins aux animaux /lignes directrices. Effectuez la décapitation avec une seule incision avec des ciseaux pointus à la base du tronc cérébral. Tenant la partie ventrale du corps à la base de la tête et à l’aide de petits ciseaux pointus, faire une incision de ligne médiane dans la peau sur toute la longueur de la tête, révélant ainsi la surface du crâne. Faire une incision longitudinale à la base du crâne et continuer à couper le long de la suture sagittale à l’aide de petits ciseaux avec un angle peu profond que possible afin d’éviter d’endommager les structures du cerveau. Peler le crâne sur les côtés à l’aide de forceps incurvés et exposer le cerveau.AVERTISSEMENT : Assurez-vous que les instruments de dissection sont exempts d’éthanol avant de toucher le cerveau. Isolez le cerveau du crâne à l’aide d’une petite spatule, en glissant sous la base du cerveau pour couper les nerfs crâniens et les vaisseaux sanguins qui sont connectés à la base du cerveau, et transférer le cerveau dans un plat Petri contenant la solution HBSS froidement complétée. Placez le plat Petri contenant le cerveau sous un microscope disséquant à faible grossissement et placez le cerveau sur sa surface dorsale. À l’aide de forceps fins, retirez les méninges du côté ventral du cerveau et des ampoules olfactives, tout en maintenant le cerveau en position par le cervelet. Faites pivoter le cerveau sur l’aspect ventral et décollez le reste des méninges.REMARQUE : L’élimination des méninges dorsales est une étape cruciale pour assurer un coup de découpage correct du cerveau. Jeter le cervelet en faisant une coupe à l’aide de forceps. Placez un papier filtre d’une taille de pore de 11 m sur un hélico de tissu(tableau des matériaux) et placez le cerveau sur le papier filtre à l’aide de forceps incurvés. Hacher le cerveau en sections coronales de 450 m et utiliser une lamina humide pour recueillir le cerveau sectionné dans un nouveau plat Petri rempli de HBSS complété par le froid. Pour disséquer le SVZ, utilisez des forceps pour séparer les tranches coronales d’une manière antérieure à postérieure jusqu’à ce qu’elles atteignent les tranches avec les ventricules latéraux, sous un microscope disséquant. Couper la fine couche de tissu entourant la paroi latérale des ventricules (qui correspond à la SVZ) avec de fines forceps, à l’exclusion du parenchyme striatal et du corpus callosum. Isoler le SVZ en plaçant la pointe des forceps dans les coins latéraux du ventricule latéral : l’un immédiatement sous le callosum de corpus et l’autre dans le tissu immédiatement adjacent à la zone ventrale du ventricule latéral. Ensuite, couper une petite ligne de tissu entourant le ventricule latéral. Recueillir le tissu disséqué dans un tube d’échantillon avec la solution HBSS complétée précédemment identifiée comme SVZ.REMARQUE : Exclure la ZSV en tranches où les ventricules latéraux et la formation hippocampe commencent à apparaître. Passez par toutes les tranches après la microdissection SVZ d’une manière antérieure à postérieure et atteindre la formation hippocampique. À l’aide de forceps, jetez la première tranche avec de l’hippocampe où la DG est encore méconnaissable. Pour enlever le DG, d’abord isoler l’hippocampe des tranches. Recentrer le microscope pour visualiser les frontières autour de la DG. Disséquer la partie DG en effectuant une coupure entre la région de la DG et du CA1 suivie d’une coupe verticale entre la DG et la région CA3 à l’aide de forceps. Enlever la fimbria et tout tissu adjacent.REMARQUE : Chez les animaux P1-3, le DG est presque indiscernable de la corne d’Ammon, mais affiche une petite pointe. Recueillir le tissu disséqué dans un tube d’échantillon contenant des solutions HBSS complétées précédemment identifiées comme DG.REMARQUE : Les blessures globales à l’hippocampe ou à la région environnante rendront plus difficile l’isolement de la DG. L’utilisation d’un atlas du cerveau de souris postnatale est essentielle lorsque l’utilisateur n’est pas familiarisé avec l’isolement du SVZ et du tissu DG des sections coronales. 3. Dissociation tissulaire Pour dissocier les tissus SVZ et DG présents dans leurs tubes respectifs, ajoutez 0,05 % trypsin-EDTA pour avoir une concentration finale de 5 à 10 % de Trypsin-EDTA 0,05 % dans le SBSS. Incuber pendant environ 15 minutes à 37 oC, jusqu’à ce que le tissu soit aggloméré. Laver le tissu de la trypsine en enlevant les médias et en ajoutant 1 ml de nouvelle solution HBSS complétée pour 4 fois consécutives. Retirez le HBSS et réutilisez le tissu digéré dans 1 ml de SFM complété par 10 ng/mL EGF et 5 ng/mL bFGF. Dissocier mécaniquement le granule en faisant monter et descendre doucement à l’aide d’une pipette P1000, jusqu’à ce qu’elle soit homogène.CAUTION : La dissociation mécanique excessive peut mener à la mort accrue de cellules et affectera négativement la croissance suivante de cellules. 4. Analyse de paire de cellules pour étudier le destin cellulaire Avant l’expérience, préparer des plaques enduites de 24 puits pour les cultures monolyer adhérentes selon les sections 8-10. Pour compter le nombre de cellules SVZ ou DG (obtenues à la section 3) à plaquer, utilisez une solution contenant 0,2% de bleu Trypan et comptez les cellules à l’aide d’un hématocytomètre. Diluer la suspension cellulaire dissociée dans SFM complétée par 5 ng/mL EGF et 2,5 ng/mL bFGF (faible EGF/bFGF) à une densité de 11 300 cellules/cm2 et les plaquer sur des housses en verre enduit. Après 24 h, fixez les cellules pour l’immunocytochemistry contre des marqueurs de NSC tels que la région de détermination de sexe 2 (Sox2) et la nestin aussi bien qu’avec un marqueur de la lignée neuronale (à savoir la doublecortine [DCX], pour les neurones immatures) (voir la section 14).REMARQUE : Sox2 est un marqueur des CNS qui subissent une mitose. Sox2paires de cellules résultant d’une seule division de cellules progénitrices reflète l’expansion des cellules souches7. 5. Expansion des cellules souches neurales postnatales en tant que néurosphères Pour déterminer la densité de la suspension dissociée de la SVZ ou de la cellule DG (obtenue à la section 3), comptez les cellules à l’aide d’un hématocytomètre. Diluer la suspension à cellule unique SVZ et DG à une densité de 2 x 104 cellules/mL en SFM complétée par 10 ng/mL EGF et 5 ng/mL bFGF. Cellules SVZ et DG de graines dans des plats Petri non revêtus de 60 mm avec un volume final de 5 ml/Petri plat. Incuber les cellules SVZ et DG pendant 6 à 8 jours et 10 à 12 jours, respectivement pour former des neurosphères primaires, à 37 oC avec 5% de CO2.REMARQUE : Les jours d’incubation plus que ceux mentionnés peuvent favoriser l’agrégation des néurosphères et des niveaux plus élevés de mort cellulaire dans le centre de la neurosphère. Lorsque la majorité des neurosphères ont un diamètre de 150 à 200 m, effectuez le passage de la neurosphère.REMARQUE : Les néurosphères de passage lorsqu’elles n’ont pas de diamètre approprié comprometnt toutes les étapes suivantes. 6. Passaging des neurosphères REMARQUE : Le protocole suivant peut être appliqué pour étendre les neurosphères SVZ et DG. Pour passer les neurosphères, recueillir le SFM avec des facteurs de croissance contenant des neurosphères à partir du plat De 60 mm Petri(es) et la centrifugeuse pendant 5 min à 300 x g. Jetez le supernatant et réutilisez la granule de neurosphère à l’aide d’un kit de dissociation chimique (souris) selon les instructions du fabricant(Tableau des matériaux).REMARQUE : Observez les temps d’incubation précisément car ils sont cruciaux pour la performance. Centrifugeuse pour 5 min à 300 x g,retirer le supernatant et ajouter 1 mL de SFM complété par 10 ng/mL EGF et 5 ng/mL bFGF. Triturate de haut en bas d’environ 10x avec une pipette P1000 pour dissocier les néurosphères. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’une solution contenant 0,2 % de bleu Trypan et un hématocytomètre. Cellules reseed à une densité de 2 x 104 cellules/mL dans les plats Non couchés de 60 mm Petri. Incuber les cellules SVZ et DG pendant 6 à 8 jours et 10 à 12 jours, respectivement pour obtenir des neurosphères secondaires, à 37 oC avec 5% de CO2.REMARQUE : La capacité d’auto-renouvellement des NSPC dérivés de SVZ et de DG peut être consultée en suivant les sections 5 et 6 du protocole. Pour cela, les cellules SVZ et DG de semences à une densité de 1,0 x 104 cellules/mL (en plaques non couchées de 24 puits) dans le milieu de croissance SFM contenant 5 ng/mL EGF et 2,5 ng/mL bFGF (faible EGF/bFGF). Comptez le nombre de neurosphères primaires et secondaires qui en résultent. 7. Stockage des neurosphères Recueillir le milieu contenant des neurosphères (obtenues à partir des étapes 5.3 et 6.7) des plats Petri de 60 mm. Centrifugeuse pendant 5 min à 300 x g et jeter le supernatant. Laver les cellules 2x avec 1 mL de HBSS (5 min à 300 x g). Centrifugeuse pendant 5 min à 300 x g,jeter le supernatant et stocker le granulé de neurosphères à -20 oC pour l’analyse de biologie moléculaire. 8. Procédure de plaque de revêtement PDL Pour préparer la solution 1 (0,1 M tampon de borate), peser 3,92 g d’acide borique et diluer dans 400 ml d’eau de haute pureté. Ajuster le pH à 8,2 et faire jusqu’à 500 ml d’eau de haute pureté. Pour préparer la solution 2 (0,167 M tampon de borate), peser 10,3 g d’acide borique et diluer dans 900 ml d’eau de haute pureté. Ajuster le pH à 8,2 et faire jusqu’à 1000 ml d’eau de haute pureté. Pour reconstituer poli-D-lysine (PDL) (1 mg/mL dans 0,1 M tampon de borate), diluer 100 mg de PDL dans 100 ml de solution 1. Faire des aliquots de 10 ml à utiliser immédiatement ou congeler et stocker à -20 oC. Sous le flux lamineur, ajouter 1 coverlip par puits et stériliser sous la lumière UV pendant 15 min. Utilisez le PDL reconstitué ou le dégel congelé de PDL reconstitué. Préparer la solution finale de 100 G/mL PDL en tampon de 0,167 M borate en ajoutant 10 ml de PDL reconstitué à 90 ml de solution 2. Ajoutez la solution finale aux puits pour un minimum de 2 h à la nuit à 37 oC.REMARQUE : Pour les plaques de 24 puits, ajoutez un volume de 500 L dans chaque puits. Retirez la solution et lavez 3x avec de l’eau de haute pureté. Laisser sécher les coverlips dans le capot de flux lamineur. Laissez les plaques de culture multi-puits à 4 oC. 9. Procédure de plaque de revêtement PDL/Laminin Le jour 1, enrober les plaques de PDL comme décrit à la section 8. Le jour 2, retirez la solution PDL et lavez 3x avec de l’eau de haute pureté. Laisser sécher. Préparer le laminin de 5 g/mL dans le SFM froid dépourvu de facteurs de croissance. Ajouter la laminine dissoute aux reprises et incuber à 37 oC pendant la nuit.REMARQUE : Pour les plaques de 24 puits, ajoutez un volume de 500 L dans chaque puits. Retirer le laminin à l’aide d’une pipette.REMARQUE : Ne lavez pas les couvertures de laminine. Utiliser immédiatement ou entreposer à -20 oC. 10. Poly-L-ornithine (PLO) /procédure de revêtement laminin Sous le flux lamineur, ajouter un coverlip par puits et stériliser sous la lumière UV pendant 15 min. Ajouter 0,01% de solution PLO à chaque puits pendant 20 minutes à température ambiante (RT).REMARQUE : Pour les plaques de 24 puits, ajoutez un volume de 500 L dans chaque puits. Retirez la solution et lavez 3x à l’adresse stérilisée 1x PBS. Laisser sécher. Préparer le laminin de 5 g/mL dans le sterile 1x PBS. Incuber pendant 2 h à 37 oC. Retirer le laminin.REMARQUE : Ne lavez pas les couvertures de laminine. Utilisez immédiatement.REMARQUE : Assurez-vous que le coverlip est entièrement recouvert par la solution PLO en tapant doucement sur le coverlip avec une pointe de pipette. Lorsqu’elles sont secouées, les plaques multi-puits ne doivent pas faire de bruit. 11. Évaluation de la neuritogenesis en générant un monolayer différencié de la cellule Recueillir des supports contenant des neurosphères à partir de plats Petri de 60 mm (obtenus à partir de la section 5) et une centrifugeuse pendant 5 min à 300 x g à RT. Jetez le supernatant et dissociez le granulé de néurosphères dans 1 ml de DISsociation PBS (c.-à-d., PBS sans Mg2 ‘/Ca2 ‘ et avec EDTA [2,7 mM KCl, 1,5 m KH2PO4, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4 et 0,5 mM EDTA 4Na, à pH à 7,40)) en incuber pendant 15 min suivi de dissociation mécanique. Alternativement, dissocier les néurosphères à l’aide d’un kit de dissociation chimique (souris)(Tableau des matériaux). Centrifugeuse pendant 5 min à 300 x g à RT et jeter le supernatant. Résuspendez la pastille de cellules dans 1 ml de SFM dépourvue de facteurs de croissance. Déterminer la densité cellulaire à l’aide d’un hématocytomètre. Diluer la suspension cellulaire dissociée dans SFM dépourvue de facteurs de croissance à une densité de 3 766 cellules/cm2 et de cellules de plaque sur des couvertures en verre enduites dans des plaques de 24 puits. Après 1 à 3 jours, fixez les cellules pour l’immunocytochemistry contre une protéine du cytosquelette (voir la section 14). 12. Différenciation des cultures de néurosphère REMARQUE : Les neurosphères obtenues à partir de l’expansion cellulaire, soit à partir de neurosphères primaires ou de passage (obtenues dans les sections 5 ou 6) peuvent être différenciées en cellules de différentes lignées neuronales. Lorsque les neurosphères ont un diamètre de 150 à 200 m, collectez 25 L de suspension de neurosphère moyenne et plaque sur des couvertures en verre enduit, dans des plaques de 24 puits.REMARQUE : Pour recueillir plus de neurosphères, faites pivoter doucement le plat Petri pour concentrer les neurosphères au centre. Puis, pipette du centre. Mettre les plaques dans un incubateur à 37 oC pendant 15 minutes afin que les neurosphères adhèrent au substrat. Ensuite, ajoutez 500 L de SFM dépourvus de facteurs de croissance (conditions différenciantes). Après 24 h, remplacez le milieu par un SFM frais dépourvu de facteurs de croissance. Différencier pour différents points de temps (p. ex., 2 et 7 jours in vitro, DIV2 et DIV7, respectivement) avec 5% de CO2 et 95% d’air atmosphérique à 37 oC.REMARQUE : La survie, la prolifération et la différenciation cellulaires peuvent être analysées à l’aide de différents essais cellulaires. 13. Essais de biologie cellulaire Analyse de survie cellulaire Exposer les neurosphères plaquées à 3 g/mL propidium iodide (PI) pendant 30 min avant fixation cellulaire dans l’incubateur à 37 oC.REMARQUE : L’IP est un agent autofluorescent qui n’est capable d’entrer que dans les cellules avec l’intégrité de membrane compromise8. D’autres méthodes d’analyse de la survie cellulaire peuvent être utilisées telles que la tache de caspase 3 ou l’essai de transfert de dUTP de de deoxynucleotidyl terminale. Analyse de prolifération cellulaire Exposer les neurosphères plaquées à 10 M 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU) pendant 4 h avant fixation dans l’incubateur à 37 oC.REMARQUE : BrdU est un analogue synthétique de thymidine qui peut être incorporé pendant la synthèse d’ADN dans les cellules proliférantes9. Analyse de différenciation cellulaire Exposez les neurosphères plaquées de 7 jours à 10 M BrdU dans les 24 premiers h, dans l’incubateur à 37 oC. Renouveler la SFM dépourvue de facteurs de croissance (conditions différenciantes) et permettre aux cellules de se développer en l’absence de BrdU pendant les 6 jours suivants jusqu’à la fixation.REMARQUE : Ces expériences de chasse au pouls, en co-étiquetant avec des marqueurs de cellules neurales matures, permettent l’évaluation des cellules progénitrices qui se différencient en cellules matures pendant le protocole. 14. Immunostaining des cultures de neurosphère Fixation cellulaire Préparer 4 % de paraformaldéhyde (PFA) en 1x PBS et entreposez à 4 oC ou -20 oC. Retirez le SFM dépourvu de facteurs de croissance des puits et ajoutez, à chaque puits, 500 L de 4% de PFA à 4 oC pendant 20 min à RT. Laver 3x avec 1x PBS, pendant 5 minutes à chaque fois, les coverlips contenant des neurosphères différenciées. Entreposez les reprises jusqu’à l’utilisation dans 500 L de 1x PBS à 4 oC.REMARQUE : Si l’expérience n’a pas De BrdU, sautez à l’étape 14.3. Méthode de dénaturation (pour les expériences BrdU seulement) Préparer 1 M HCl à 37 oC. Rincer coverslips 3x en 1x PBS. Perméabiliser les cellules pendant 30 min dans PBS contenant 1% de surfactant non ionique (par exemple, Triton X-100). Denature dsDNA avec 1 M HCl préchauffé à 37 oC pendant 30-40 min à 37 oC (300 l/l/puits). Laver les puits 4x avec 1x PBS. Perméabilisation et blocage Rincer les coverlips en 1x PBS pendant 5 min. Incubate pour 1,5 h avec 0,5% de surfactant non ionique et 3% de sérum bovin albumin (BSA) en 1x PBS (300 ‘L/puits).REMARQUE: Pour NeuN, utilisez 6% de BSA dans 1x PBS. Incubation et montage Le jour 1, sans lavage, incuber les cellules avec anticorps primaires (Tableau des matériaux) dans 0,1% surfactant non ionique et 0,3% BSA en 1x PBS dans la chambre d’incubation (pour 24-puits plaques utilisent 20 ‘L/puits). Laissez les couvertures incuber pendant la nuit à 4 oC de lumière protégée si les anticorps sont conjugués à un fluorophore. Le jour 2, retourner les couvertures à leurs puits respectifs et rincer 3x en 1x PBS pendant 5 min. Contre-détention avec des anticorps secondaires conjugués de fluorescence appropriés (dilution 1:200) et avec 12 ‘g/mL Hoechst 33342 en 1x PBS pour 2 h à RT et lumière protégée dans la chambre d’incubation (20 L/coverslip). Laver les coverlips 3x en 1x PBS pendant 5 min. Monter des couvertures sur des lames de microscope à l’aide de 5 L/coverslip de fluorescence de montage moyen. Laissez les couvertures sécher à l’air à RT, à l’abri de la lumière, pendant 1 jour. Microscopie Afficher et acquérir des images à l’aide d’un microscope à fluorescence. Pour chaque condition, utilisez trois répliques. Effectuez des nombres de cellules dans cinq champs microscopiques indépendants dans chaque coverlip avec un objectif 40x (100 cellules par champ). 15. Préparation des solutions d’actions EGF et bFGF Solution d’actions EGF Pour reconstituer lyophilized EGF, diluer le produit dans de l’eau de haute pureté pour atteindre une concentration finale de 20 g/mL. Aliquot et stocker dans des microtubes à -5 à -20 oC. solution d’actions bFGFREMARQUE : bFGF doit être reconstitué avec une solution de 10 mM Tris, pH 7.6. Centrifugez brièvement la fiole avant l’ouverture pour amener le contenu au fond. Préparer 50 mL de 10 mM Tris, pH 7,6. Pour cela, peser 60,57 mg de Tris ((HOCH2)3CNH2) et le diluer dans 40 ml d’eau de haute pureté. Ajuster le pH à 7,6 et faire jusqu’à 50 ml d’eau de haute pureté. Préparer 10 mL de 0,1% BSA en 10 mM Tris, pH 7,6. Pour cela, peser 10 mg de BSA et le diluer en 10 ml de Tris de 10 mM. Solutions de filtre préparées dans les étapes 15.2.2 et 15.2.3 avec un filtre de 0,22 m sous un capot de flux lamineur. Reconstituer 10 g de bFGF dans 1 000 L de 0,1 % de BSA en 10 mM Tris avec pH 7,6 pour atteindre une concentration finale de 10 g/mL. Aliquot en microtubes à -20 oC pendant un maximum de 6 mois.