Estudio de los efectos neuroconductuales de los contaminantes ambientales en las larvas de peces cebra
Summary
En este documento se presenta un protocolo experimental detallado para la evaluación de la toxicidad neuroconductual de contaminantes ambientales utilizando un modelo de larvas de pez cebra, incluyendo el proceso de exposición y pruebas para indicadores neuroconductuales.
Abstract
En los últimos años se han demostrado que cada vez más contaminantes ambientales son neurotóxicos, especialmente en las primeras etapas de desarrollo de los organismos. Las larvas de pez cebra son un modelo preeminente para el estudio neuroconductual de contaminantes ambientales. Aquí, se proporciona un protocolo experimental detallado para la evaluación de la neurotoxicidad de los contaminantes ambientales utilizando larvas de pez cebra, incluyendo la recolección de los embriones, el proceso de exposición, indicadores neuroconductuales, el proceso de prueba, y análisis de datos. Además, se discuten el entorno de cultivo, el proceso de exposición y las condiciones experimentales para garantizar el éxito del ensayo. El protocolo se ha utilizado en el desarrollo de fármacos psicópatas, investigación sobre contaminantes neurotóxicos ambientales, y puede ser optimizado para hacer estudios correspondientes o ser útil para estudios mecánicos. El protocolo demuestra un proceso de operación claro para estudiar los efectos neuroconductuales en las larvas de peces cebra y puede revelar los efectos de diversas sustancias neurotóxicas o contaminantes.
Introduction
En los últimos años se han demostrado más y más contaminantes ambientales neurotóxicos1,2,3,4. Sin embargo, la evaluación de la neurotoxicidad in vivo después de la exposición a contaminantes ambientales no es tan fácil como la de la alteración endocrina o la toxicidad del desarrollo. Además, la exposición temprana a contaminantes, especialmente en dosis ambientalmente relevantes, ha atraído cada vez más atención en los estudios de toxicidad5,6,7,8.
El pez cebra se está estableciendo como un modelo animal apto para estudios de neurotoxicidad durante el desarrollo temprano después de la exposición a contaminantes ambientales. Los peces cebra son vertebrados que se desarrollan más rápido que otras especies después de la fertilización. Las larvas no necesitan ser alimentadas porque los nutrientes en el coro son suficientes para sostenerlas durante 7 días después de la fertilización (dpf)9. Las larvas salen del coro a 2 dpf y desarrollan comportamientos como natación y torneado que se pueden observar, rastrear, cuantificar y analizar automáticamente utilizando instrumentos de comportamiento10,11,12,13 a partir de 3-4 dpf14,15,16,17,18. Además, las pruebas de alto rendimiento también se pueden realizar mediante instrumentos de comportamiento. Por lo tanto, las larvas de pez cebra son un modelo excepcional para el estudio neuroconductual de contaminantes ambientales19. Aquí, se ofrece un protocolo utilizando monitoreo de alto rendimiento para estudiar la toxicidad neuroconductual de contaminantes ambientales en larvas de peces cebra bajo estímulos ligeros.
Nuestro laboratorio ha estudiado la toxicidad neuroconductual de 2,2′,4,4′-tetrabromodifenilo éter (BDE-47)20,21, 6′-Hidroxi/Methoxy-2,2′,4,4′-éter de tetrabromodifenilo (6-OH/MeO-BDE-47)22, éter de difenilo deca-brominado (BDE-209), plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo, plomo y parafinas cloradas comerciales23 utilizando el protocolo presentado. Muchos laboratorios también utilizan el protocolo para estudiar los efectos neuroconductuales de otros contaminantes en larvas o peces adultos24,25,26,27. Este protocolo neuroconductual se utilizó para ayudar a proporcionar apoyo mecánico que muestra que la exposición a dosis bajas al bisfenol A y al bisfenol S de reemplazo induzcan neurogénesis hipotalámica prematura en el pez cebra embrionario27. Además, algunos investigadores optimizaron el protocolo para realizar los estudios correspondientes. Un estudio reciente eliminó la toxicidad de la beta amiloide (A) en un modelo de pez cebra fácil y de alto rendimiento utilizando nanopartículas de oro recubiertas de caseína (Cas AuNPs). Demostró que las AuNPs de las Cas en circulación sistémica se trasladaron a través de la barrera hematoencefálica de las larvas de peces cebra y secuestraron el A42 intracerebral, provocando toxicidad de una manera inespecífica, similar a la acompañante, que estaba respaldada por la patología conductual28.
La locomoción, el ángulo de trayectoria y la actividad social son tres indicadores neuroconductuales utilizados para estudiar los efectos de la neurotoxicidad de las larvas de peces cebra después de la exposición a contaminantes en el protocolo presentado. La locomoción se mide por la distancia de natación de las larvas y puede dañarse después de la exposición a contaminantes. El ángulo del camino y la actividad social están más estrechamente relacionados con la función del cerebro y el sistema nervioso central29. El ángulo de trayectoria se refiere al ángulo de la trayectoria del movimiento animal en relación con la dirección de natación30. En el sistema se establecen ocho clases de ángulo s/180o-+180o. Para simplificar la comparación, seis clases en el resultado final se definen como giros de rutina (-10o, 0o+ 10o), giros medios (-10o-90o, +10o+90o) y giros responsivos (-180o-90o, +90o+180o) según nuestros estudios anteriores21,22. La actividad social de dos peces es fundamental para el comportamiento de los bancos de grupo; aquí una distancia de < 0,5 cm entre dos larvas válidas se define como contacto social.
El protocolo presentado aquí demuestra un proceso claro para estudiar los efectos neuroconductuales en las larvas de peces cebra y proporciona una manera de revelar los efectos de neurotoxicidad de diversas sustancias o contaminantes. El protocolo beneficiará a los investigadores interesados en estudiar la neurotoxicidad de los contaminantes ambientales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo proporciona un protocolo experimental detallado para evaluar la neurotoxicidad de los contaminantes ambientales utilizando larvas de peces cebra. El pez cebra pasa por el proceso desde embriones hasta larvas durante el período de exposición, lo que significa que el buen cuidado de los embriones y larvas es esencial. Cualquier cosa que afecte el desarrollo de los embriones y larvas puede influir en el resultado final. Aquí se discuten el entorno de cultivo, el proceso de exposición y las condiciones exper…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo financiero de la National Natural Science Foundation of China (21876135 y 21876136), el National Major Science and Technology Project of China (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), la Fundación del MOE-Shanghai Laboratorio Clave de Salud Ambiental Infantil (CEH201807-5), y Consejo Sueco de Investigación (Núm. 639-2013-6913).
Materials
| 48-well-microplate | Corning | 3548 | Embyros housing |
| 6-well-microplate | Corning | 3471 | Embyros housing |
| BDE-47 | AccuStandard | 5436-43-1 | Pollutant |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Cosolvent |
| Microscope | Olympus | SZX 16 | Observation instrument |
| Pipette | Eppendorf | 3120000267 | Transfer solution |
| Zebrabox | Viewpoint | ZebraBox | Behavior instrument |
| Zebrafish | Shanghai FishBio Co., Ltd. | Tubingen | Zebrafish supplier |
| ZebraLab | Viewpoint | ZebraLab | Behavior software |
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