Изучение нейроповеденческих воздействий экологических загрязнителей на личинки зебрафиш
Summary
Подробный экспериментальный протокол представлен в этой работе для оценки нейроповеденческой токсичности загрязнителей окружающей среды с использованием модели личинок зебры, включая процесс воздействия и тесты на нейроповеденческие показатели.
Abstract
В последние годы все больше и больше загрязнителей окружающей среды оказались нейротоксическими, особенно на ранних стадиях развития организмов. Личинки зебрафиш являются выдающейся моделью для нейроповеденческого исследования загрязнителей окружающей среды. Здесь предусмотрен подробный экспериментальный протокол для оценки нейротоксичности загрязняющих веществ окружающей среды с использованием личинок зебры, включая сбор эмбрионов, процесс воздействия, нейроповеденческие показатели, процесс испытаний и анализа данных. Кроме того, для обеспечения успеха ассссы обсуждаются культурная среда, процесс экспозиции и экспериментальные условия. Протокол был использован в разработке психопатических препаратов, исследования экологических нейротоксических загрязнителей, и может быть оптимизирован, чтобы сделать соответствующие исследования или быть полезным для механистических исследований. Протокол демонстрирует четкий процесс работы для изучения нейроповеденческого воздействия на личинки зебры и может выявить эффекты различных нейротоксических веществ или загрязняющих веществ.
Introduction
В последние годы все больше и больше загрязнителей окружающей среды были доказаны нейротоксические1,2,3,4. Однако оценка нейротоксичности in vivo после воздействия загрязнителей окружающей среды не так проста, как оценка эндокринных нарушений или токсичности развития. Кроме того, раннее воздействие загрязняющих веществ, особенно в экологически значимых дозах, привлекает все большее внимание в исследованиях токсичности5,6,7,8.
Зебрафиш в настоящее время устанавливается в качестве модели животных, пригодных для нейротоксичности исследований во время раннего развития после воздействия экологических загрязнителей. Зебрафиши являются позвоночными, которые развиваются быстрее, чем другие виды после оплодотворения. Личинки не нужно кормить, потому что питательные вещества в хорионе достаточно для поддержания их в течение 7 дней послеоплодизации (dpf)9. Larvae выйти из хора на 2 dpf и развивать поведение, такие как плавание иповорот,который можно наблюдать, отслеживается, количественно, и анализируются автоматически с помощью инструментов поведения10,11,12,13, начиная с 3-4 dpf14,15,16,17,18. Кроме того, высокопроизводительные тесты также могут быть реализованы с помощью поведенческих инструментов. Таким образом, личинки зебры являются выдающейся моделью для нейроповеденческого исследования загрязнителей окружающей среды19. Здесь протокол предлагается с использованием высокой пропускной способностью мониторинга для изучения нейроповеденческой токсичности загрязнителей окружающей среды на личинках зебры под легкими стимулами.
Наша лаборатория изучила нейроповеденческую токсичность 2,2′,4,4′-тетрабромодифенил эфир (BDE-47)20,21, 6′-Гидрокси / Метокси-2,2′,4,4′-tetra Bromodiiphenyl ether (6-OH/MeO-BDE-47)22, дека-броминированный дифениловый эфир (БДЭ-209), свинец и коммерческие хлорированные парафины23 с использованием представленного протокола. Многие лаборатории также используют протокол для изучения нейроповеденческих эффектов других загрязнителей на личинок или взрослых рыб24,25,26,27. Этот нейроповеденческий протокол был использован, чтобы помочь обеспечить механистической поддержки, показывающие, что низкие дозы воздействия бисфенола А и замены бисфенола S индуцированных преждевременного гипоталамического нейрогенеза в эмбриональных зебрафиш27. Кроме того, некоторые исследователи оптимизировали протокол для проведения соответствующих исследований. Недавнее исследование исключило токсичность бета-амилоида (АЗ) в простой модели зебры с высокой пропускной способностью с использованием наночастиц золота с покрытием казеина (Cas AuNPs). Он показал, что «Cas AuNPs в системном циркуляции трансумтризировался через гематоэнцефалический барьер личинок зебры и поглощенных внутримозговых АЗ42, вызывая токсичность в неспецифической, сопровождающей, как образом, которая была поддержана поведенческой патологией28.
Локомотив, угол пути и социальная активность являются тремя нейроповеденческими индикаторами, используемыми для изучения нейротоксических эффектов личинок зебры после воздействия загрязняющих веществ в представленном протоколе. Локомотив измеряется расстоянием плавания личинок и может быть поврежден после воздействия загрязняющих веществ. Угол пути и социальная активность более тесно связаны с функцией мозга и центральной нервной системы29. Угол наклона относится к углу пути движения животных относительно направления плавания30. В системе установлены восемь угловых классов от 180 -180. Для упрощения сравнения, шесть классов в конечном исходе определяются как обычные повороты (-10 “0”, 0 “10”, средние повороты (-10 “-90”, “10” (90) и отзывчивые повороты (-180 “-90”, “90” (180) в соответствии с нашими предыдущими исследованиями21,22. Двухрыбная социальная активность является основополагающей для группового поведения; здесь расстояние злт; 0.5 cm между 2 личинками действительными определено как социальный контакт.
Представленный здесь протокол демонстрирует четкий процесс изучения нейроповеденческого воздействия на личинки зебры и дает возможность выявить нейротоксичность различных веществ или загрязняющих веществ. Протокол принесет пользу исследователям, заинтересованным в изучении нейротоксичности загрязнителей окружающей среды.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта работа обеспечивает подробный экспериментальный протокол для оценки нейротоксичности загрязняющих веществ окружающей среды с использованием личинок зебры. Зебрафиш проходит через этот процесс от эмбрионов до личинок в период экспозиции, что означает, что хороший уход за эмбрион…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарны за финансовую поддержку со стороны Национального фонда естественных наук Китая (21876135 и 21876136), Национального крупного научно-технического проекта Китая (2017-X07502003-03, 2018-X07701001-22), Фонда МЧС-Шанхай Ключевая лаборатория охраны окружающей среды детей (CEH201807-5) и Шведский научно-исследовательский совет (No 639-2013-6913).
Materials
| 48-well-microplate | Corning | 3548 | Embyros housing |
| 6-well-microplate | Corning | 3471 | Embyros housing |
| BDE-47 | AccuStandard | 5436-43-1 | Pollutant |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Cosolvent |
| Microscope | Olympus | SZX 16 | Observation instrument |
| Pipette | Eppendorf | 3120000267 | Transfer solution |
| Zebrabox | Viewpoint | ZebraBox | Behavior instrument |
| Zebrafish | Shanghai FishBio Co., Ltd. | Tubingen | Zebrafish supplier |
| ZebraLab | Viewpoint | ZebraLab | Behavior software |
References
- Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (12), 2931-2940 (2016).
- Tian, L., et al. Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction. Scientific Reports. 5, 16117 (2015).
- Rauh, V. A., Margolis, A. E. Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57 (7), 775-793 (2016).
- Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children. Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).
- Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. . Environmental Organic Chemistry. , (2016).
- Akortia, E., et al. A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments. Environmental Reviews. 24 (3), 253-273 (2016).
- Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations. Archives of Toxicology. 90 (9), 2077-2107 (2016).
- Landrigan, P. J., et al. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1230-1233 (2005).
- Xu, T., Yin, D. The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).
- Panula, P., et al. Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases. Zebrafish. 3 (2), 235-247 (2006).
- Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine. Psychopharmacology. 234 (4), 549-558 (2017).
- Bailey, J. M., et al. Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish. Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).
- Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (77), e50622 (2013).
- Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4 (3), 567-576 (2008).
- Yuhei, N., et al. Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenital Anomalies. 55 (1), 1-16 (2015).
- Wu, S., et al. TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio). Environmental Toxicology. 31 (10), 1241-1249 (2016).
- Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 65 (2016).
- Wehmas, L. C., et al. Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish. Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).
- Cavalieri, V., Spinelli, G. Environmental epigenetics in zebrafish. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 46 (2017).
- Zhang, B., et al. Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae. Chemosphere. 169, 542-549 (2017).
- Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes. Chemosphere. 94, 53-61 (2014).
- Zhang, B., et al. Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae. Chemosphere. 200, 30-35 (2018).
- Yang, X., et al. The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).
- Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).
- Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level. Chemosphere. 224, 445-454 (2019).
- Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos?. Environmental Science & Technology. 53 (1), 482-493 (2018).
- Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (5), 1475-1480 (2015).
- Javed, I., et al. Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
- Tytell, E. D. The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed. Journal of Experimental Biology. 207 (19), 3265-3279 (2004).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4, (2000).
- Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish. Journal of Agro-Environment Science. 36 (3), 481-486 (2017).
- Macphail, R. C., et al. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
- Kais, B., et al. DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET). Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. . Drug Safety Evaluation. , 271-279 (2011).
- Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments. Zebrafish. 13 (4), 330-334 (2016).
- Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects. Genes, Brain and Behavior. 11 (3), 366-373 (2012).
- Blaser, R., Penalosa, Y. Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test. Physiology & Behavior. 104 (5), 831-837 (2011).
- Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7 (5), e36931 (2012).
- Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio. Chemosphere. 186, 43-50 (2017).
