In Vitro Yönettiği Evrim bir Kısıtlama Enonuklelease Daha Sıkı Özgüllük ile

1. ESC’lerin hazırlanması Düşük kopya numarası plazmid (örneğin, pACYC184 veya pACYC174 veya bunların türevleri) olarak tasarlanacak kısıtlama-modifikasyon sisteminin klonme metiltransferazı.NOT: Bakteriyel konak suşu klonlanmış enzim tarafından tanıtılan metilasyontore ve T7 RNA polimeraz indüklenebilir ifade sağlamak gerekir. ER2566 suş (McrA, McrBC ve Mrr mutasyonları taşıyan) kullanılması tavsiye edilir. Rekombinant plazmid DNA’sının, enzim tedarikçisi tarafından 2 saat boyunca önerilen tampon ve sıcaklıkta 10 ünite cognate REase ile 0,5 g plazmid DNA’sı ile 0,5 g plazmid DNA’sı tedavi edilerek koloktate karşı korunduğunu doğrulayın. Bu türün yetkin hücrelerini hazırlayın.NOT: Herhangi bir yöntem kullanılabilir. NlaIV mühendislik projesi basit bir kalsiyum klorür yöntemi12kullanılır. Farklı bir dışlama grubundan T7 organizatörü kontrolü altında REase için ORF ile rekombinant plazmid ve adım 1.1 metiltrasferase geni içeren bir farklı bir seçim belirteci ile inşa. PET28 ve pET30 vektörleri kullanılabilir. Sessiz mutasyonlar(Şekil 2, Tablo 1A) tanıtarak T7 organizatörü ve ORF enziminin stop kodonu arasındaki rekombinant plazmidin bölümünden mühendislik enziminin tüm tanıma bölgelerini çıkarın.NOT: Birden fazla bu sitenin çıkarılması gerekiyorsa, birden fazla mutasyon turu gerekecektir (adım 1.5.1-1.5.7). Astarların 5′ ucunda tanıtılan tasarlanmış varyasyonlarla tam uzunlukta plazmidi güçlendiren bir iç-dış PCR reaksiyonu kullanın(Tablo 2A). PCR reaksiyonunun 50°L’ine 10 U DpnI enonukleaz ekleyerek şablon DNA’sını çıkarın ve 37 °C’de 2 saat kuluçkaya yatırın. Agarose jel elektroforez ile ürünleri çözün. Tam uzunlukta plazmid karşılık gelen bant kesip ve ticari bir kit ile arındırın. 10x ligasyon tampon (1x konsantrasyonu için) ekleyin ve ATP (1 mM) ile ek. 37 °C’de 20 dakika boyunca 10 U T4 polinükleotid kinaz ve kuluçka ekleyin. 10 dakika boyunca 70 °C’de ısıtın. PEG 4000 ila%5, ATP (1 mM) ile tekrar ek ve 5 U T4 DNA ligaz ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat (RT) kuluçka. Cognate metetiltransferaz taşıyan yetkin bir bakteri suş dönüştürün (adım 1.1). Plazmid DNA’sını küçük ölçekte izole edin ve dideoksi dizileme ile dizi değişikliklerinin girişini onaylayın. Oligonükleotid güdümlü mutagenezinin hedef açtığı sekans(lar)a yakın benzersiz kısıtlama sitelerini tanıtın (Şekil 2, Tablo 1B). Her site için 1.5.1-1.5.7 adımlarını izleyin.NOT: Bu adım yalnızca hedeflenen mutagenez kullanıldığında gerçekleştirilir. Rasgele mutagenezi yapıyorsanız, 2-3 adımlarını atlayın ve bunun yerine bölüm 3’e ilerleyin. Sunulan örnekte tüm siteler hedeflenen bölgelerin yukarısına tanıtıldı, ancak onlar da aşağı tanıtılabilir. ESC’nin (Tablo 1C) yükseltilmesi için tasarım astarları. Seçilen NlaIV dizisinin dışına bağlanan ve 5′ sonunda biotin içeren, seçilen tanıma sitesini (R1) ve daha kısa sürümünü (R2) tanıtacak olan ensonüklelease ORF’nin ters astar bağlama alt akışı tasarlayın (Bkz. Şekil 1). T7 organizatörün ESC upstream’ine bağlanan bir ileri astar (F1) tasarla. Bu astar aynı zamanda orijinal tanıma dizisinin karşı seçimli varyantını(lar) tanıtmalıdır (yani, seçilen ters dizi hariç orijinal enzim tarafından tanınan en fazla dizi varyasyonları).NOT: Bu astarın (F2) seçili dizideki distal dizisini kapsayan daha kısa bir sürümü daha sonra seçici PCR’de (adım 5.9) kullanılacaktır. 2. Mutajenik Astarların Bölünüp Karıştırılması NOT: Bu adım yalnızca birden fazla sitede subsatürasyon mutagenezi gerektiren projeler için kullanılır. Birden çok sentez sütunları olan bir sentezleyici gereklidir. Randomize NNS kodon üçüzlerinin ve yabani tip kodon üçlülerinin mutagenez frekanslarına göre sentezi için sütunlar atayın. Örneğin, yedi eşit hacimli sentez sütunu varsa ve belirli bir sitede 0,3 mutagenez oranı arzu ediliyorsa, ~0,3 x 7 veya iki sütunda randomize NNS kodonları ve ~0,7 x 7 veya beş sütundaki yabani tip kodonları ekleyin(Şekil 3). Subsatürasyon mutagenezi için siteler hakkında karar verin. Sitelerin varsayımsal önemine göre mutagenez frekanslarını seçin (yani, site ne kadar önemlise, frekans o kadar yüksektir), genel kütüphane karmaşıklığını göz önünde bulundurun (Bkz. Tartışma). Tüm kolonlarda oligonükleotidsentez, 3′-uçtan sayma ikinci subsatürasyon mutagenesis sitehemen öncesinde üçüz kadar. Son sentez döngüsünde 5′-trityl koruma grubunu çıkarmayın (synthesizer’daki trityl-on seçeneğini kullanın). Koruma grubu bir sonraki sentez döngüsünün başında kaldırılacaktır (Şekil 3’tekiadım 1). Sentez sütunlarını açın. Kontrollü gözenek cam (CPG) sentez desteğikuru 1,5 mL tüp içine toplamak ve girdap tarafından karıştırın. Karışık CpG recinin yeni sentez sütunlarına bölünmesi. Genel verimi azaltacağı için nemi tanıtmaktan kaçının (Şekil 3’teki2 ve 4. adımlar). Subsatürasyon mutagenez bölgesi üçüz başlayarak, sentezdevam edin. İstenilen mutagenez frekansına göre rastgele NNS üçüzlerine veya yabani tip üçüzlere sütun atayın (yukarıdaki nota bakın). Ek subsatürasyon alanları varsa, sadece bir sonraki subsatürasyon mutagenesis bölgesinden önceki üçüz bölgeye ilerleyin. Yine, sonunda bir 5′-trityl grubu bırakın (synthesizer üzerinde 5′-trityl-on seçeneği) (Şekil 3’teadım 3). Sonra adım 2.3 ile devam edin. Akıntının aşağısında başka subsatürasyon alanı yoksa, sentezi tamamlayın ve sonunda 5′-trityl grubu bırakarak (synthesizer’da 5′-trityl-on seçeneği) (Şekil 3’tekiadım 5). Saflaştırma kartuşunu üreticinin talimatlarına göre oligonükleotid kitaplığını koruyun ve arındırın.NOT: KSK’dan deprotection tarafından salınan oligonükleotidler de ters faz yüksek performanslı sıvı kromatografisinde (HPLC) trityl-on ile saflaştırılabilir ve ardından manuel tritil grubu çıkarılması (RT’de asetik asitle 1 saat tedavi) ve ikinci bir HPLC saflaştırması. Bir üre-PAGE jel oligonükleotid kütüphane kalitesini kontrol edin. 3. Varyant Kütüphaneleri Oluşturma NOT: Adım 1.6 rekombinant plazmid kullanın. Oligonükleotid yönelimli mutagenez ile kütüphaneler oluşturun.NOT: Alternatif olarak, EP-PCR protokolünü (adım 3.2) kullanın. T7 promotöründen mutagenez ile hedeflenen diziyi çevreleyen benzersiz restriksiyon enzim bölgesine bir bölümü yükseltin (NlaIV durumunda: SalI, EcoRI veya Eco52I)(Tablo 1B-C, Tablo 2B, Şekil 4). İkinci bölümü benzersiz restriksiyon enzim bölgesinden ESC’nin 3′ ucuna kadar yükseltin. PCR reaksiyonlarının 5 μL’sini (adım 3.1.1’den) 8°L su, 10x restriksiyon enzimtamponu 1.5 l ve uygun restriksiyon enzimlerinin (SalI, EcoRI veya Eco52I) 5 ünitesini karıştırın ve 2 saat için uygun sıcaklıkta kuluçkaya yatırın. Agarose jel elektroforezkullanarak her iki reaksiyonun ürünlerini çözün. Beklenen boyut bantlarını kesin ve ticari bir kit ile arındırın. Bir agarose jel saflaştırılmış ürünlerin 1/3 kadar çalıştırın ve densitometri ile her safbant konsantrasyonu ölçmek. 1x ligaz tampon ve 1 U T4 DNA ligaz ve RT 2 saat için inkübat ile 1:1 molar oranı ESCs iki bölümünün ligasyon ayarlayın. Agarose jelreaksiyon ürünleri çözmek. Beklenen boyuttaki ürünleri kesin ve ticari bir kit ile arındırın. Arınmış ligasyon ürünlerini PCR reaksiyonunda f1 ve R2 astarları(Tablo 1C ve Tablo 2A)ile yükseltin. 20’den fazla amplifikasyon döngüsü çalıştırmayın. Bir agarose jel PCR reaksiyonları fraksiyone. Ürünleri kesip ticari bir kit ile arındırın. Agarose jel önceki adımdan saflaştırılmış kütüphane bir 5 μL aliquot çalıştırın ve densitometri ile konsantrasyonu ölçmek. Mutasyon sıklığını ve dağılımını kontrol etmek için kitaplığın küçük bir örneğini (5 μL’ye kadar) ve sıra >15 klonlar klonlar (Tablo 3). Adım 4’e geçin.NOT: Alternatif olarak, ESC’lerin küçük numunesinin yüksek iş elde sıralaması kullanılabilir. EP-PCR gerçekleştirin. Adım 1.5.7’de elde edilen plazmidden ESC’yi F1 ve R1 astarları ile yükseltin. Taq I polimeraz(Tablo 1B)ile 20 döngü çalıştırın. Jel PCR ürün arındırmak. Önceki adımdan 2 ng saflaştırılmış PCR ürünüyle EP-PCR’yi ayarlayın ve F1 ve R1 astarlarla 15 döngü EP-PCR(Tablo 1C)çalıştırın. Jel ürünü arındırın ve jel densitometri ile ölçün.NOT: Saflaştırılmış EP-PCR ürününün düşük konsantrasyonu nedeniyle sayısallaştırma için yaklaşık 1/3 kullanın. Mutasyon sıklığını ve dağılımını kontrol etmek için kitaplığın küçük bir örneğini (1/5’e kadar) ve sıra >15 klonlar klonlar (Tablo 4).NOT: Alternatif olarak, ESC’lerin küçük örneğinin yüksek iş yapma örneklemesini gerçekleştirin. 4. Bölümlü İn Vitro Transkripsiyon-çeviri Reaksiyonu In vitro transkripsiyon-çeviride ensonükleaz ekspresyonu ve enzimatik aktiviteyi test edin. Dekolte reaksiyonu kolayca tespit edilebilmek için molekülün merkezine yakın bulunan ensonükleaz için tek bir tanıma alanı ile kısa (200-500 bp) bir substrat hazırlayın.NOT: Substratı hazırlamanın en kolay yolu, herhangi bir DNA molekülünün uygun bir parçasının PCR amplifikasyonudur. Dekolte tespitini kolaylaştırmak için alt tabaka radyoetiketli veya floresan olarak etiketlenebilir. Üreticinin tavsiyelerine göre 0,5 g vahşi tip ESC ile 50 μL transkripsiyon-çeviri reaksiyonu ayarlayın. Magnezyum tuzu ekleyin (MgCl2, MgSO4, ve magnezyum asetat test edilebilir) 1.5 mM ve bir önceki adımdan substrat uygun miktarda (en az 0.5 μg etiketsiz DNA durumunda).NOT: Magnezyum tarafından aktive nükleaz içermeyen herhangi bir transkripsiyon / çeviri kiti kullanılabilir. Bazı kit satıcıları üretim sırasında DNA kontaminasyonunu gidermek ve daha sonra nükleaz inhibitörleri olarak şelatörler eklemek için nükleaz kullanın. Bu tür kitleri bu yöntem ile uyumlu değildir. Transkripsiyon-çeviri reaksiyonu üreticinin talimatlarına göre kuluçkaya yatırın. Daha sonra reaksiyon karışımını 2 saat boyunca restriksiyon enzimi için en uygun sıcaklığa aktarın. Bir agarose jel içinde substrat dekolte analiz uygun algılama (örneğin, DNA boyama, floresan görüntüleme veya otoradyografi)(Şekil 5).NOT: Bölme işlemine devam etmeden önce substratın en azından kısmi bölünmesi gereklidir. Bu elde edilmezse, magnezyum kimyasal formu veya konsantrasyonu daha fazla optimizasyon gereklidir. 15 mL konik bir tüpe 225 μL Span 80 ve 25 μL’lik 80 ila 5 mL mineral yağ ekleyerek yağ sürfaktan karışımı hazırlayın. Tüpü 15x ters çevirerek iyice karıştırın. Her kütüphane için 950 μL yağ sürfaktan karışımını 2 mL yuvarlak alt kriyojenik şişeye, kütüphane adı içeren etikete aktarın ve buza aktarın. Her şişenin içine küçük bir silindirik karıştırma çubuğu (5 x 2 mm2)koyun. Üreticinin önerilerine göre bir in vitro transkripsiyon-çeviri reaksiyon karışımı (her kütüphane için 50 μL) hazırlayın. Karışımı magnezyum klorür ile 1,5 mM’lik son konsantrasyona tamamlayın (bkz. adım 4.1.4). Buz üzerinde 1,5 mL tüpler içine 50 μL aliquots dağıtın. Buz üzerindeki reaksiyon karışımına kütüphaneden 1,7 fmole (bölüm 3’ten) ekleyin.NOT: Seçim verimliliği için daha yüksek miktarda ifade kitaplığı kullanmayın. Birden fazla DNA molekülü içeren sulu damlacıkların sıklığını en aza indirmek çok önemlidir. Her kütüphane için art arda yağ içi su emülsiyonunu hazırlayın. 1.150 rpm olarak belirlenen karıştırma hızı ile manyetik bir karıştırıcı üzerinde buz dolu küçük bir kabı (veya büyük şişe fincan) koyun. 950 μL yağ sürfaktan karışımı ve 4.3 adımdan küçük bir karıştırma çubuğuna sahip kriyojenik bir şişeyi manyetik karıştırıcıdaki buz gibi bir kabına aktarın. Karıştırma çubuğunun döndüğünü kontrol edin. 30 s aralıklarla 2 dakika süre içinde in vitro kütüphane-transkripsiyon-çeviri karışımı beş 10 μL aliquots ekleyin ve ek bir dakika karıştırmaya devam edin. Emülsiyon ile şişeyi bir buz kabına aktarın. Adım 4.7.2 ile başlayan bir sonraki kitaplığı ile devam edin. Tüm kütüphaneler işlendikten sonra kit üreticisinin önerilerine göre tüm kütüphanelerin kuluçkaya yatmaktadır. Ek bir 2 saat için mühendislik enonukleaz için optimum sıcaklık şişeleri aktarın ve daha sonra en az 10 dakika buz üzerine koyun. 5. Kütüphanelerin Sürekli İşlenmesi ve Seçimi Kriyojenik şişelerden emülsiyonları soğuk 1,5 mL tüplere aktarın, 0,5 M EDTA’nın 1 μL’sini ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13.000 x g’da santrifüj edin. Bir pipet ile üst yağ fazını çıkarın. Bir yağ-su interfazı görülmezse, sulu fazı dondurmak için tüpü en az 5 dakika -20 °C’de kuluçkaya yatırın ve hemen sıvı yağ fazını dışarı çıkarın. 10 mM Tris HCl pH 8.0 100 μL ekleyin ve hemen 150 μL fenol ile ekstraksiyon gerçekleştirin:kloroform (1:1 v/v) kısa girdap ve ardından faz ayırma 30 s santrifüj ile 13.000 x g. Üst sulu faz toplayın. 3 M sodyum asetat (pH = 5,2), 2,5-5 g glikojen ve 2,5 vol (375 μL) etanol 0,1 vol (15 μL) ekleyerek DNA’yı çökeltin. -20 °C’de 1 saat, santrifüj 15 dakika 13.000 x g, 4 °C’de kuluçka. Supernatant atın ve kısaca soğuk% 70 etanol 1 mL ile pelet yıkayın. KURU DNA / glikojen pelet bir speedvac veya hava kuru >5 dk. Peleti 10 mM Tris-HCl’nin 50 μL’lik (pH = 7,5) olarak eritin. Üreticinin talimatlarına göre hazırlanan 5 μL streptavidin manyetik boncukekleyin ve rt’de 1 saat boyunca, tercihen bir atlıkarınca karıştırıcısında veya nazik girdaplarla karıştırın. Bir manyetik standı üzerinde boncuk ayırın ve biotin olmadan DNA zenginleştirilmiş sıvı toplamak. DNA’yı etanol çökeltme ile yoğunlaştırın (adım 5.4-5.5). 5 μL su önceki adımdaki konsantre DNA’yı çözün ve F2 ve R1 astarlarla PCR reaksiyonunda şablon olarak kullanın(Tablo 1A).NOT: Şablon kontaminasyonu ile ilgili sorunları önlemek ve PCR yapılarını en aza indirmek için Taks polimeraz (Pfu veya Phusion değil) kullanın ve şablon boyutuyla orantılı uzatma süresiyle 18-20 döngü çalıştırın (Tablo 2B’yebakın). PCR ürünlerini bir agarose jelde kesirle ve beklenen boyuttaki ürünü kesin. Bazı bulaşmalar farklı boyutlarda ürünler olduğunu gösterir (bkz. Şekil 6). Ticari bir kit ile jel levha DNA arındırın. Adım 5.10’dan 50 ng’ye kadar DNA ve adım 5.9’daki yle aynı protokolü kullanarak F1 ve R2’den 50 ng’ye kadar ikinci bir PCR reaksiyonu uygulayın. 5.10’da açıklandığı gibi ürün arınma ile devam edin. Agarose jel densitometri (UV spektroskopisi değil) ile nicel leştirme densitometrisinden sonra saflaştırılmış DNA in vitro seçiminin bir sonraki turunda kullanılabilir (adım 4.6). 6. Değiştirilmiş Sıra Özgüllüğü için ekran varyantları Seçili türevlerini klonla. Ürünü, orf’nin klonlanması için uygun olan 10 U kısıtlama enzimi ile 2 saat için adım 5.10’dan, enzim satıcısı tarafından önerilen sıcaklık ve tamponda (NlaIV: NcoI ve XhoI için) sindirin. Agarose jel elektroforez ile ürünleri çözün ve beklenen boyut parçası izole. Plazmid vektörü (örneğin, pET28) adım 6.1.1’deki yle aynı enzimlerle çift dekolte ile hazırlayın ve ürünü ticari bir DNA jel saflaştırma kiti ile arındırın. Agarose jel elektroforezile densitometri ile vektör ve insert konsantrasyonlarını tahmin edin. T4 DNA ligaz ve vektör 1-5 U ile bir ligasyon kurmak:insert molar oranı 1:3-1:5 enzim satıcısı tarafından önerilen 1x ligaz tampon. RT 2 saat için kuluçka ve uygun konak bakteri içine tanıtmak (adım 1.3) dönüşüm veya elektroporasyon12. Uygun antibiyotik (pET28 veya pET30 vektörleri için 50 μg/mL kanamisin) ve %1 glikoz içeren LB plakalarında ektransformantları seçin. Ekspres protein varyantları. Tek kolonileri dönüşümden (24 klontek bir koşuda kolayca işlenebilir) kanamisin (50 μg/mL) ve %1 glikoz ile 2 mL LB’ye dönüştürün ve sallayarak bir gecede 37 °C’de büyütün. 100 g kanamisin içeren 15 mL ılık (37 °C) LB inoculate ve gecelik kültürün 0.75 mL ile glikoz ve güçlü sallayarak 37 °C’de kuluçka.NOT: 50 mL santrifüj tüpler veya 100 mL Erlenmayer matarakullanılabilir. 1 mL gecelik kültüre 176 μL gliserol ekleyin (gliserol son konsantrasyonu = ) iyice karıştırın ve -70 °C’de dondurun. 2-3 h ek sonra 15 mL kültür (adım 6.2.1) IPTG ile 1 mM ve kültür ek 5 saat için. Bakteriyel peleti santrifüj (10.000 x g, 4 °C, 10 dk) toplayın ve -70 °C’de dondurun. Protein çeşitlerini arındırın. 20 μL nikel afinite reçine süspansiyonu 1,5 mL’lik bir tüpte 200 μL B1 tamponuna aktarın, geniş delikli pipet ucu ile hafifçe karıştırın ve santrifüj (5.000 x g, 30 s, 4 °C). Pipetleme ile supernatant çıkarın ve buz üzerinde tüp bırakın. Bakteriyel peleti 300 μL B1’de 6.2.5’ten güçlü girdaplarla yeniden askıya alın. Süspansiyonu 1,5 mL’lik bir tüpe aktarın. B1’e 3 μL 100x proteaz inhibitör kokteyli ve lizom solüsyonu ekleyin (1 mg/mL’lik son konsantrasyon). Bir ucu donanımlı sonda ile sonication ile hücreleri parçalamak. Aradaki buzda >15 s ucu soğutma süresi ile numune başına altı adet 10 s patlama kullanın. Hücre süspansiyonlarını her zaman buzda tutun. Santrifüj (2 dk, 12.000 x g, 4 °C) ile pelet hücre enkazı ve adım 6.3.1’den 250 μL supernatant’ı reçine aliquot’a aktarın. Soğuk bir odada 15 dakika, tercihen bir atlıkarınca mikseri veya nazik girdap ile karıştırın. Santrifüj (5.000 x g, 30 s, 4 °C) ve bir pipet ile supernatant aspire. 500 μL W arabelleği ekleyin ve reçiyiyi yavaşça yeniden askıya alın. Santrifüj (5.000 x g, 30 s, 4 °C) ve bir pipet ile supernatant aspire. Adımı 6.3.7’yi tekrarlayın. 20 μL arabellek E ekleyin, reçineyi yavaşça yeniden askıya alın ve numuneyi 2-5 dk. Santrifüj (5.000 x g,30 s, 4 °C) için buzüzerinde bırakın ve süpernatant’ı toplayın. Adımı 6.3.9’u tekrarlayın. Havuz süpernatları. Protein örneklerini SDS-PAGE (5-10 μL) ile analiz edin (Şekil 7). Değiştirilmiş özgüllüklü varyantlar için ekran. Bakteriyofaj lambda DNA’sında ki test bölünmesi aktivitesi. Protein örneği son reaksiyon hacminin ‘una kadar olabilir. 0,5 g DNA’da toplam 2 μL protein örneği ve 2 saat reaksiyon süresi iyi bir başlangıç noktasıdır. Yabani tip enzim tarafından üretilen ürünler ile birlikte agarose jel elektroforez ile reaksiyon ürünleri analiz edin. Daha fazla analiz için yabani tip enzim tarafından üretilen den açıkça ayırt edilebilir dekolte desenleri üreten klonlar seçin (Şekil 8).