В Vitro Направленная эволюция ограничения Эндонуклеза с более строгой спецификой
Summary
Ограничение эндонуклеазы с новой специфичностью последовательности может быть разработано из ферментов, распознающих частично вырожденную последовательность. Здесь мы предоставляем подробный протокол, который мы успешно использовали, чтобы изменить специфику последовательности фермента NlaIV. Ключевыми составляющими протокола являются разобщенности транскрипции/перевода и выбор вариантов с новой последовательностью.
Abstract
Ограничение эндонуклеазы (REase) инженерии специфичности чрезвычайно трудно. Здесь мы описываем многоступенчатый протокол, который помогает производить варианты REase, которые имеют более строгую специфичность, чем родительский фермент. Протокол требует создания библиотеки кассет выбора выражения (ESCs) для вариантов REase, в идеале с изменчивостью в позициях, которые могут повлиять на связывание ДНК. ESC окружен с одной стороны последовательностью для деятельности места ограничения пожеланной и биркой biotin и с другой стороны местом ограничения для нежелательной деятельности и грунтовое место annealing. ESCs транскрибируются и переводятся в эмульсию воды в масле, в условиях, которые делают присутствие более чем одной молекулы ДНК на каплю маловероятной. Поэтому ДНК в каждой кассетной молекуле подвергается только активности переведенного, закодированного фермента. Варианты REase желаемой специфики удаляют тег и биотин, но не сайт грунтовки. После разрушения эмульсии молекулы ДНК подвергаются спадению биотина, и сохраняются только те, что находятся в супернатанте. Этот шаг уверяет, что сохраняются только ESC для вариантов, которые не потеряли желаемую активность. Эти молекулы ДНК затем подвергаются первой реакции ПЦР. Расщепление в нежелательной последовательности отрезает сайт связывания грунтовки для одного из грунтовок. Таким образом, ПЦР усиливает только ESC из капель без нежелательной деятельности. Затем проводится вторая реакция ПЦР для повторного введения места ограничения для желаемой специфики и метки биотина, с тем чтобы можно было повторить этап отбора. Выбранные открытые рамки чтения могут быть переэкспрессированы в бактериальных клетках, которые также выражают коньяк метилтрансферазы родительской REase, потому что недавно развилась REase цели только подмножество метилтрансферазы целевых сайтов.
Introduction
Инженерия специфичности последовательности является чрезвычайно сложной задачей для класса II REases. В этом классе эндонуклеазы распознавание последовательности и катализ и катализ тесно переплетены, скорее всего, как эволюционная гарантия против создания эндонуклизии более широкой специфичности, чем ее cognate метилтрансферазы, которая повредит ДНК хозяина. Направленная эволюция новых особенностей в клетках еще больше осложняется необходимостью защиты ДНК хозяина от недавно сконструированной эндонуклеазной деятельности. Таким образом, Есть только несколько успешных попыток REase инженерных сообщили, и все они используют уникальные особенности конкретного фермента1,,2,33,24,,55,6,7.
Здесь мы предоставляем подробный протокол для разработки специфики, которые могут быть использованы для создания вариантов эндонуклеаза, которые имеют более узкую специфичность, чем родительский фермент, который основан на нашей успешной инженерии nlaIV эндонуклеазы8. Для любого такого фермента с произвольной последовательностью распознавания, дополнительная специфичность может быть введена для баз в флангах. Для родительских ферментов, распознаваемых частично вырожденных последовательностей (таких как NlaIV с целью GGNNCC), дополнительная специфичность также может быть введена в последовательности распознавания. Поскольку дополнительная специфичность, скорее всего, потребует контактов с белковыми ДНК, вновь признанные базы должны лежать в пределах родительской эндонуклеазы ДНК. В принципе, схемы отбора могут быть созданы для любой желаемой специализации последовательности распознавания. Тем не менее, большинство REases, которые признают palindromic и почти palindromic целевых последовательностей функциональных dimers, которые признают только половина участка палиндром. Таким образом, выбор новых особенностей, нарушающих симметрию белковых нуклеационных взаимодействий, вряд ли сработает. Для димерической NlaIV, например, последовательность GGNNCC теоретически может быть сужена до GGATCC, но сужение специфичности до GGAACC, как ожидается, будет более трудным. Наша схема предполагает как положительный, так и отрицательный отбор.
Этот процесс является более эффективным, когда отрицательный выбор также используется для удаления специфики, способной расщеплять все последовательности, кроме предпочтительной более узкой специфичности. Например, выбор для GGATCC может быть объединен с антивыбором против GGBVCC (где B является какой-либо базой, кроме A, и V является любой базой, кроме T). Когда некоторые из возможных целевых последовательностей не охвачены, результат ы отбора эксперимента зависит от эффективности положительного и отрицательного отбора. В нашей работе NlaIV, мы выбрали для GGATCC, и против GGSSCC (где S G или C), и получили специфичность, которая, игнорируя цели нарушения симметрии, может быть описана как GGWWCC (где W является A или T), предполагая, что в данном конкретном случае, отрицательный выбор был более важно, чем положительный отбор.
Наш подход начинается с создания кассеты выбора выражения (ESC). ESC состоит из секций. На внутренней основной части, Есть варианты открытого чтения кадра (ORF) Из REase, под t7 промоутер управления. Этот основной раздел ESC не может содержать какой-либо cognate сайт для инженерии REase. Ядро зажато между двумя когнатными участками для дикого типа REase: место расщепления для нежелательной деятельности (контрвыбранная последовательность, GGSCCв этом примере) и сайт расщепления для желаемой деятельности (выбранная последовательность, GGATCC в примере). Заключительный этап подготовки ESC в ПЦР добавляет биотин близко к желаемой активности в 5′ конце и создает различные счетчиквыбранных последовательностей (GGSSCC в примере). Стратегия отбора основывается на использовании тщательно разработанных праймеров в протоколе повторного амплификации ESC после транскрипции/перевода/перевода/выбора протокола(рисунок 1A). Библиотека ESC выражается в in vitro разрозненном транскрипционном переводе воды в масле эмульсии99,10,,11. В каждой капле, специфика выраженного фермента влияет на состояние ESC(Рисунок 1B,шаг I). Для описанного расположения, желаемая активность расщепления переведенного белка удаляет биотин тег ДНК, но не влияет на другой конец ESC с встречной выбранной последовательности. Когда эмульсия сломана, биотининатированные фрагменты удаляются стрептавидином сродством выпадения, так что только фрагменты из капель с желаемой активностью остаются(Рисунок 1B,шаг II). Этот шаг удаляет неактивные варианты REase. Супернатантная фракция выдвижной ступени затем усиливается ПЦР. В первой реакции ПЦР используются праймеры F2 и R1(рисунок 1A,B,шаг III). Primer F2 связывается с разделом ESC между выбранной последовательностью счетчика и концом молекулы. Таким образом, ESCs, выражающие варианты, способные расщеплять выбранную последовательность счетчика (и, следовательно, отделить места связывания для грунтовок F2 и R1 на две разные молекулы ДНК) не усиливаются и, таким образом, удаляются из библиотеки. Праймер R1 связывается между выбранным участком и ядром ESC, чтобы он не был подвержен статусу расщепления выбранного участка и восстанавливает место расщепления для желаемой деятельности (GGATCC). Цикл закрывается вторым ПЦР (с праймерами F1 и R2), который добавляет биотин в конце 5’близко к выбранному участку и восстанавливает разработанный вариант на выбранном участке счетчика близко к противоположному концу ESC(Рисунок 1B,шаг IV). Полученная смесь ДНК готова к очередному раунду отбора.
Успех протокола отбора сильно зависит от правильного выбора новой, более строгой последовательности распознавания целей и тщательного проектирования стратегии мутагенеза и ее эффективной реализации. Потому что это гораздо легче улучшить на незначительные уже существующие предпочтения REase, чем преодолеть их, мы рекомендуем начать с кинетического изучения любых уже существующих предпочтений. Необходимость тщательного проектирования мутагенеза обусловлена ограниченным размером библиотеки мутантов, которые могут быть обработаны представленным протоколом (109 клонов в одном эксперименте). Поэтому все 20 возможных замен аминокислот могут быть эффективно протестированы лишь в нескольких позициях (см. Обсуждение). Случайный мутагенез, такой как подверженные ошибкам ПЦР (EP-PCR), представленный в качестве альтернативного метода, приведет к глубокому недовыборке существующей сложности. Если какая-либо информация о потенциальных аминокислотных позициях, участвующих в контактах с ДНК (или даже расположенных в непосредственной близости от дегенеративных нуклеотидов в cognate последовательности) имеется, она, безусловно, следует использовать для выбора нескольких аминокислот для олигонуклеотида руководствоваться насыщения мутагенеза (протокол шаги 1,6-3.10).
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол отбора, описанный здесь, был протестирован для NlaIV8, димерической PD-(D/E)XK последовательности распознавания, которая распознает палиндромный целевой сайт с центральными базами NN и катализает тупой конец разреза между базами NN. NlaIV был выбран потому что расщепление между основаниями NN предлагает что эти основания близко к протеину в комплексе. В принципе, протокол может быть использован для любой последовательности конкретных ограничений эндонуклеазы, мономерные или димерические, любой группы раза, катализируя двойные разрывы нити любого шата, независимо от того, каталитические и специфика доменов совпадают (как в примере NlaIV) или являются отдельными (например, FokI). Более того, протокол в принципе полезен не только для генерации новой, более узкой ферментной специфичности, но и может быть использован для устранения звездной деятельности или для создания высокой эндонуклеазы верности. Однако все это еще не было проверено. В частности, целенаправленная ликвидация звездной активности может быть осложнена тем, что те же остатки аминокислот могут быть связаны с привязкой к желаемым и нежелательным основаниям. Шаги in vitro, описанные в этом протоколе, не ограничиваются выбором суженных специфических, но также могут быть использованы для выбора измененных в противном случае особенностей. Однако, есть тогда проблема с вариантом эндонуклеазы: если спектр субстратов включает в себя новые цели, не расщепленные родительской эндонуклеазы, то в целом нет хорошего способа защитить клетки от вредного воздействия этой деятельности. В отличие от этого, если эндонуклеазная специфичность только сужается, цели подмножество диких целей типа, и, следовательно, уже доступны cognate метилтрансферазы должны быть полностью защитные.
Наш протокол отличается в нескольких отношениях от многих направленных протоколов эволюции. Разнообразие открытого кадра чтения генерируется один раз в начале эксперимента, а не во всех итерациях. Более того, он создается путем синтеза сплит-микса, а не EP-PCR. Для замен ы кодонов НСН, используемых в этой работе, есть (4 х 4 х 2)6 и 1,07 х 109 комбинаций для шести позиций. Таким образом, любой данный вариант присутствует в среднем один раз в 1,7 fmoles ESC. Эта емкость может быть увеличена до семи позиций с помощью синтеза со смесью 20 прекурсоров тринуклеотида, которые предлагаются Glen Research или за счет уменьшения частоты мутаций в менее перспективных позициях с синтезом сплит-и-микс олигонуклеотидов. По возможности рекомендуется ограничить степень вариации шестью позициями. Очевидно, что такой адресный мутагенез требует некоторых уже существующих знаний о по крайней мере регионах REase, участвующих в привязке субстрата. Протокол сплит-микс для создания разнообразия имеет явные преимущества по сравнению с EP-PCR. Используя EP-PCR, мы получили неизменные варианты и последовательности, несущие восемь замен для NLaIV ESCs в том же EP-PCR (таблица 4). Библиотека EP-PCR содержит значительную часть клонов, которых следует избегать (дикие последовательности типов, множественные замены, смещение кадров и мутации ерунды, а также мутации в местах, которые вряд ли повлияют на специфичность последовательности).
Наш протокол также отличается от многих других направленных протоколов эволюции наличием двух последовательных шагов отбора. Положительный выбор гарантирует, что желаемая активность сохраняется, в противном случае тег биотина не удаляется, а последовательность кодирования может быть удалена путем вытягивания вниз. Технически возможно, что случайное появление романа, не перекрывающихся специфичности (например, GCATGC) может привести к разрыву биотина тега, а, если подходящий сайт расщепления присутствует вблизи желаемого расщепления, но не в другом месте. Однако это должно быть крайне маловероятно. Отрицательный выбор удаляет открытые рамки чтения, которые кодируют ферменты, которые все еще имеют нежелательную активность. Этот шаг не является строго обязательным, поскольку протокол по-прежнему обогащает библиотеку вывода вариантами, которые способны расщеплять последовательность выбора, но не в состоянии расщеплять в другом месте В ESC, что делает его непригодным для усиления ПЦР. Тем не менее, эффективность отбора, как ожидается, будет ниже, потому что ферменты с оригинальной специфичностью последовательности не будут удалены из вывода и превзойти перспективные варианты с измененной специфичностью, но и снижение ферментатической активности. Обратите внимание, что на уровне популяции как желаемые, так и нежелательные целевые последовательности могут, но не должны быть, вырождаться. В примере nlaIV анти-цель была вырожденной, а цель недегенерацией. Даже при вырождения на уровне населения, в одной капли присутствует только одна (недегенеративная) цель или противоцельный. В нашем протоколе целевые и антицелевые последовательности вновь вводятся при каждом повторении шагов отбора. Таким образом, открытая рамка чтения должна кодировать фермент, способный расщеплять все возможные цели, и не в состоянии расщеплять любой из анти-целей, чтобы выжить несколько раундов отбора. Обратите внимание, что необходимость повторного введения цели антивыбора при каждой итерации протокола обеспечивает соблюдение двух последовательных ПЦР. Первый ПЦР использует грунтовку, которая андалинируется за пределами антицели, так что расщепление анти-цели предотвращает реакцию ПЦР. Второй PCR требует грунтовки, которая выходит за рамки анти-цели, и вновь вводит анти-цели, чтобы убедиться, что во время нескольких раундов отбора, каждый открытый кадр чтения проверяется против всех вариантов анти-цели.
Для ферментов, которые генерируют липкие концы, может быть использован соответствующий альтернативный протокол, основанный на ранее описанном методе изоляции REase ORF10. Истощение неактивных вариантов биотина захвата, который используется в наших экспериментах заменяется в альтернативном протоколе путем перевязки совместимого адаптера с последовательностью, которая используется в качестве сайта связывания грунтовки в селективном ПЦР(Рисунок 9). Только ESCs, которые производят ферменты с выбранной специфичности генерировать перевязки способных концов и, следовательно, будут выбраны. Последовательность липкого конца выбранной последовательности счетчика должна быть разработана таким образом, чтобы она не смогли участвовать в перевязывания с адаптерами. Итерация процесса отбора может быть легко достигнута путем переключения между двумя различными адаптерами и, следовательно, двумя различными обратными праймерами в селективном ПЦР.
Даже с новыми протоколами, задача инженерных новых особенностей в пробирке по-прежнему очень сложной задачей. Для типичного типа II REases, специфичность последовательности и эндонуклелитической активности зависят от одних и тех же белковых регионов. Поэтому трудно изменить одно, не затрагивая другое. Успех делается более вероятно, стратегия, которая учитывает след фермента, уважает симметрию белково-ДНК взаимодействий, и опирается на уже существующие ферментативные предпочтения, которые должны быть определены авансом в биохимических экспериментов, как это было сделано для nlaIV пример8.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Министерства науки и высшего образования (0295/B/PO1/2008/34 до Mb и N301 100 31/3043 до KS), от Польского национального научного центра (НКН) (УМО-2011/02/A/N/00052, UMO-2014/13/B/N’1/03991 и UMO-2014/14/M/N’5/00558 до MB) и краткосрочные стипендии EMBO ks (ATSF 277.00-05).
Materials
| 1000Å CPG Support (dA, dT, dC, dG) | Biosset | 45-1000-050 | Other vendors can be used as well |
| ASM-800 DNA/RNA | Biosset | 800-001-000 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | Any other kit can be used |
| Glen-Pak DNA purification cartridge | Glen Research | 60-5200 | |
| HIS-Select Nickel Affinity Gel | Sigma | P6611 | |
| pET 28a vector | Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead | ||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F530S | Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead |
| Porous steel foil | Biosset | 40-063 | |
| Rapid Translation System RTS 100, E.coli HY Kit |
Roche | 3 186 148 | |
| Restriction endonucleases | Thermo Scientific | Obviously other vendors, enzymes can be used | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma |
| Synthesis chemicals including phosphoramidities | Carl Roth | Other vendors can be used as well | |
| Synthesis columns (different sizes) | Biosset | ||
| T4 DNA ligase | Thermo Scientific | EL0011 | Any other ligase can be used |
References
- Schöttler, S., Wenz, C., Lanio, T., Jeltsch, A., Pingoud, A. Protein engineering of the restriction endonuclease EcoRV–structure-guided design of enzyme variants that recognize the base pairs flanking the recognition site. European Journal of Biochemistry. 258 (1), 184-191 (1998).
- Wenz, C., Hahn, M., Pingoud, A. Engineering of variants of the restriction endonuclease EcoRV that depend in their cleavage activity on the flexibility of sequences flanking the recognition site. Biochemistry. 37 (8), 2234-2242 (1998).
- Samuelson, J. C., Xu, S. Y. Directed evolution of restriction endonuclease BstYI to achieve increased substrate specificity. Journal of Molecular Biology. 319 (3), 673-683 (2002).
- Samuelson, J. C., et al. Engineering a rare-cutting restriction enzyme: genetic screening and selection of NotI variants. Nucleic Acids Research. 34 (3), 796-805 (2006).
- Rimseliene, R., Maneliene, Z., Lubys, A., Janulaitis, A. Engineering of restriction endonucleases: using methylation activity of the bifunctional endonuclease Eco57I to select the mutant with a novel sequence specificity. Journal of Molecular Biology. 327 (2), 383-391 (2003).
- Morgan, R. D., Luyten, Y. A. Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity. Nucleic Acids Research. 37 (15), 5222-5233 (2009).
- Skowronek, K., Boniecki, M. J., Kluge, B., Bujnicki, J. M. Rational engineering of sequence specificity in R.MwoI restriction endonuclease. Nucleic Acids Research. 40 (17), 8579-8592 (2012).
- Czapinska, H., et al. Crystal Structure and Directed Evolution of Specificity of NlaIV Restriction Endonuclease. Journal of Molecular Biology. 431 (11), 2082-2094 (2019).
- Miller, O. J., et al. Directed evolution by in vitro compartmentalization. Nature Methods. 3 (7), 561-570 (2006).
- Zheng, Y., Roberts, R. J. Selection of restriction endonucleases using artificial cells. Nucleic Acids Research. 35 (11), e83 (2007).
- Takeuchi, R., Choi, M., Stoddard, B. L. Redesign of extensive protein-DNA interfaces of meganucleases using iterative cycles of in vitro compartmentalization. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), 4061-4066 (2014).
- Howland, J. L., Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Short Protocols in Molecular Biology. , (1995).
- Wilson, D. S., Keefe, A. D. Chapter 8 Unit 8.3: Random mutagenesis by PCR. Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
