より厳格な特異性を有する制限エンドヌクレアーゼのインビトロ指向進化

1. ESCの準備 低コピー数プラスミド(例えば、pACYC184またはpACYC174またはそれらの誘導体)で操作される制限修飾系のメチルトランスファーーゼのクローン。注:細菌宿主株は、クローン酵素によって導入されたメチル化を許容し、T7 RNAポリメラーゼの誘導可能な発現を提供できる必要があります。ER2566株(McrA、McrBC、およびMrr突然変異を運ぶ)の使用が推奨されます。 組換えプラスミドDNAが、酵素供給業者が2時間推奨する10単位の共生ReEaseで0.5μgのプラスミドDNAを処理することにより、同結合エンドヌクレアーゼによる切断から保護されていることを確認します。 この株の有能な細胞を準備します。注:任意の方法を使用できます。NlaIVエンジニアリングプロジェクトは、単純な塩化カルシウム法12を使用しました。 異なる排除基から T7 プロモーターの制御下にある REase 用 ORF を用いて組換えプラスミドを構築し、ステップ 1.1 でメチルトラスフラーゼ遺伝子を含むものとは異なる選択マーカーを使用する。ベクトル pET28 および pET30 を使用できます。 T7プロモーターと酵素ORFの停止コドンとの間の組換えプラスミドのセクションから、無声変異を導入して、操作酵素の認識部位をすべて取り除く(図2、表1A)。注:複数のそのようなサイトを削除する必要がある場合は、複数のミューテーションラウンドが必要です (ステップ 1.5.1 ~ 1.5.7)。 プライマーの5’の端部に導入された設計されたバリエーションで全長プラスミドを増幅するインサイドアウトPCR反応を使用する(表2A)。 PCR反応の50 μLにDpnIエンドヌクレアーゼを10 U添加して鋳型DNAを除去し、37°Cで2時間インキュベートする。 アガロースゲル電気泳動により製品を解決します。全長プラスミドに対応するバンドを切り取り、市販キットで精製します。 10xライゲーションバッファー(1倍の濃度)を加え、ATP(1 mMまで)で補います。T4ポリヌクレオチドキナーゼを10U添加し、37°Cで20分間インキュベートする。70°Cで10分間加熱して酵素を不活性化する。 PEG 4000~5%を加え、ATP(1 mM)で再度補い、T4 DNAリガーゼを5 Uに加えます。室温(RT)で2時間インキュベートする。 同じメチルトランスファーーゼを運ぶ有能な細菌株に変身(ステップ1.1)。 プラスミドDNAを小規模に分離し、ディデオキシシーケンシングによる配列変化の導入を確認する。 オリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発によって標的となる配列に近い固有の制限部位を導入する(図2、表1B)。各サイトの手順 1.5.1 ~ 1.5.7 に従います。注:このステップは、標的性変異誘発が使用される場合にのみ実行されます。ランダム突然変異誘発を行う場合は、手順 2 ~ 3 をスキップし、代わりにセクション 3 に進みます。この例では、すべてのサイトがターゲット領域の上流に導入されましたが、下流にも導入できます。 ESCの増幅用のプライマーを設計する(表1C)。 選択した認識部位(R1)とその短いバージョン(R2)を導入するエンドヌクレアスORFの逆プライマー結合を設計し、選択されたNlaIV配列の外側に結合し、5’末端にビオチンを含む(図1を参照)。 T7プロモーターのESC上流に結合するフォワードプライマー(F1)を設計する。このプライマーはまた、元の認識シーケンスのカウンター選択されたバリアント(すなわち、選択された逆配列を除いて元の酵素によって認識される最大の配列変動)を導入する必要があります。注:このプライマーの短いバージョン(F2)は、選択PCR(ステップ5.9)で後で使用される、副選択されたシーケンスに遠位のシーケンスをカバーする。 2. 変異原性プライマーのスプリットアンドミックス合成 注:この手順は、複数のサイトで亜飽和変異生成を必要とするプロジェクトでのみ使用されます。複数の合成列を持つシンセサイザーが必要です。変異発生頻度に応じて、ランダム化NNSコドン三つ子と野生型コドン三つ子の合成のためのカラムを割り当てる。例えば、7つの等量合成カラムが利用可能で、特定の部位で0.3の変異生成率が望ましい場合、ランダム化NNSコドンを〜0.3 x 7または2列に、野生型コドンを〜0.7 x 7または5列に追加する(図3)。 亜飽和変異体の部位について決定します。.サイトの仮定の重要性に従って変異発生頻度を選択します(すなわち、サイトの重要性が高いほど頻度が高くなります)、ライブラリ全体の複雑さに関する制限を念頭に置いてください(説明を参照)。 オリゴヌクレオチドを全てのカラムで合成し、3’末端から数える第2亜飽和変異形成部位の直前の三重項まで合成する。最後の合成サイクルで5′-トリチウム保護基を除去しないでください(シンセサイザーのトリチルオンオプションを使用してください)。保護基は、次の合成サイクルの開始時に除去されます (図 3のステップ 1)。 合成列を開きます。制御された細孔ガラス(CPG)合成サポートを乾燥した1.5 mLチューブに集め、渦を混ぜて混ぜます。混合CPG樹脂を新しい合成カラムに再パーティション化します。湿度の導入は、全体的な収量が低下するため避けてください(図 3のステップ 2 と 4)。 合成を継続し、亜飽和変異誘発部位トリプレットから始まる。カラムを、所望の突然変異発生頻度に従ってランダム化NNS三小または野生型三つ子に割り当てます(上記の注を参照)。追加の亜飽和部位が存在する場合は、次の亜飽和変異形成部位の前に三重項に進む。ここでも、5′-トリチウム基を最後に置いたままにします(シンセサイザーの5′-トリチルオンオプション)(図3のステップ3)。次に、ステップ 2.3 に進みます。 下流に亜飽和部位が存在しない場合は、合成を完了し、5′-トリチウム基を最後に残す(シンセサイザーの5′-トリチウムオンオプション)(図3のステップ5)。 精製カートリッジメーカーの指示に従ってオリゴヌクレオチドライブラリーを保護解除し、精製してください。注:CPGから脱保護によって放出されるオリゴヌクレオチドは、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)でトリチウムイオン除去(RTで80%酢酸で1時間処理)および第2のHPLC精製を続けて精製することもできる。 尿素ページゲルのオリゴヌクレオチドライブラリーの品質を確認してください。 3. バリアントライブラリの生成 注:ステップ1.6の組換えプラスミドを使用してください。 オリゴヌクレオチド指向変異生成によりライブラリを生成する。注: EP-PCR プロトコルを使用することもできます(ステップ 3.2)。 T7プロモーターから変異誘発を標的とする配列に隣接するユニークな制限酵素部位までのセクションを増幅する(NlaIVの場合:SalI、EcoRI、またはEco52I)(表1B-C、表2B、図4)。ユニークな制限酵素部位からESCの3’末端まで第2部を増幅します。 8 μLの水、10x制限酵素バッファーの1.5 μL、および適切な制限酵素(SalI、EcoRI、または Eco52I)の5単位を用いて、PCR反応を5 μL(ステップ3.1.1から)別々に混合し、適切な温度で2時間インキュベートします。 アガロースゲル電気泳動を用いて、両反応の生成物を解決します。予想サイズのバンドを切り取り、市販キットで精製します。 アガロースゲルで精製された製品の1/3まで実行し、濃度測定によって各精製バンドの濃度を測定します。 1xリガーゼバッファーとT4 DNAリガーゼの1 Uを用いた1:1モル比でESCの2つの部分のライゲーションを設定し、RTで2時間インキュベートします。 アガロースゲル中の反応生成物を解決します。期待サイズの製品を切り取り、市販キットで浄化します。 プライマーF1およびR2とのPCR反応で精製されたライゲーション生成物を増幅する(表1Cおよび表2A)。20以上の増幅サイクルを実行しないでください。 アガロースゲル中のPCR反応を分画する。製品を切り取り、市販キットで浄化します。 アガロースゲルの前のステップから精製されたライブラリーの5 μLアリコートを実行し、濃度測定法によって濃度を測定する。 ライブラリの小さなサンプル(最大5μL)とシーケンス>15クローンをクローン化して、突然変異の頻度と分布を確認します(表3)。手順 4 に進みます。注:あるいは、ESCの小サンプルのハイスループットシーケンシングを使用することもできます。 EP-PCR を実行します。 ステップ1.5.7で得られたプラスミドからESCをプライマーF1およびR1で増幅する。Taq Iポリメラーゼ(表1B)で20サイクルを実行する。 ゲルはPCR産物を精製する。 前のステップから精製 PCR 産物の 2 ng で EP-PCR を設定し、F1 および R1 プライマーを使用して 15 サイクルの EP-PCR (表 1C) を実行します。 ゲルは製品を精製し、ゲル密度測定によって定量化します。注:精製されたEP-PCR産物の低濃度のため、定量化に約1/3を使用した。 ライブラリの小さなサンプル(最大1/5)とシーケンス>15クローンをクローン化して、突然変異の頻度と分布を確認します(表4)。注:または、ESC の小さなサンプルのハイスループットシーケンスを実行します。 4. 区分化インビトロ転写翻訳反応の実施 インビトロ転写翻訳におけるエンドヌクレアーゼ発現および酵素活性を試験する。 分子の中心近くに位置するエンドヌクレアーゼの認識部位を1つ備えた短い(200~500 bp)基材を用意し、切断反応を容易に検出できるようにします。注:基質を調製する最も簡単な方法は、任意のDNA分子の適切な断片のPCR増幅によってである。基質は、切断検出を単純化するために、放射標識または蛍光標識を行うことができる。 メーカーの推奨に従って、0.5 μgの野生型ESCで50μLの転写変換反応を設定します。マグネシウム塩(MgCl2、MgSO4、および酢酸マグネシウムを試験可能)を1.5mMに加え、前工程から適切な量の基質(標識なしDNAの場合は0.5μg以上)を加えます。2注:マグネシウムで活性化されたヌクレアーゼを含まない転写/翻訳キットを使用できます。一部のキットベンダーは、製造中のDNA汚染を除去し、ククレアーゼ阻害剤としてキレート剤を添加するためにヌクレアーゼを使用しています。このようなキットは、この方法と互換性がありません。 製造者の指示に従って転写翻訳反応をインキュベートします。その後、制限酵素に対する最適な温度に反応混合物を2時間移動させる。 アガロースゲル中の基質の切断を分析し、その後適切な検出(例えば、DNA染色、蛍光ビジュアライゼーション、またはオートラジオグラフィー)を分析する(図5)。注:区画化を進める前に、少なくとも基板の部分的な切断が必要である。これが達成されない場合は、マグネシウムの化学的形態またはその濃度のさらなる最適化が必要である。 15 mL円錐形チューブに225 μLのスパン80と25 μLのTween 80~5 mLの鉱油を加えて、油界面活性剤を調製します。管15倍を優しく反転して十分に混ぜます。 各ライブラリは、油界面活性剤混合物の950 μLを2mLの丸底極低温バイアルに移し、ライブラリ名でラベルを付け、氷に移します。小さな円筒形の攪拌棒(5 x 2 mm2)を各バイアルに入れます。 メーカーの提案に従って、インビトロ転写変換反応混合物(ライブラリごとに50 μL)を用意します。塩化マグネシウムを加えた混合物を1.5 mMの最終濃度に補います(ステップ4.1.4を参照)。 氷上の1.5 mLチューブに50 μLのアリコートを分配します。 氷上の反応混合物にライブラリ(セクション3から)の1.7 fmoleを加えます。注:選択効率を高くするために、より多くの式ライブラリを使用しないでください。複数のDNA分子を含む水性液滴の頻度を最小限に抑えることが重要です。 各ライブラリに連続して油中水エマルジョンを準備します。 1,150 rpmに設定された攪拌速度で、磁気スターラーに氷で満たされた小さなビーカー(または大きなボトルカップ)を置きます。 950 μLの油界面活性剤混合物と小さな攪拌棒を備えた極低温バイアルを、ステップ 4.3 から磁気攪拌機の氷冷ビーカーに移します。攪拌バーが回転していることを確認します。 30秒間隔で2分間にわたってin vitroライブラリ転写変換混合物の5つの10 μLアリコートを加え、さらに1分間攪拌を続けます。エマルジョンを使用してバイアルを氷容器に移します。ステップ 4.7.2 から始まる次のライブラリに進みます。 すべてのライブラリが処理された後、キットメーカーの推奨事項に従って、すべてのライブラリのインキュベーションを開始します。 バイアルを、さらに2時間、設計されたエンドヌクレアーゼに最適な温度に移し、少なくとも10分間氷の上に置きます。 5. ライブラリと選択の継続的な処理 低温バイアルから冷たい1.5 mLチューブにエマルジョンを移し、0.5 M EDTAの1μLを加え、室温で5分間13,000 x gで遠心分離します。 ピペットで上部オイル相を取り除きます。油水相が見えない場合は、水相を凍結するために-20°Cで少なくとも5分間チューブをインキュベートし、すぐに液体油相をパイプアウトします。 10 mM Tris HCl pH 8.0の100 μLを加え、13,000 x gで30秒の遠心分離を経て、短い渦を流してフェノール:クロロホルム(1:1 v/v)の150 μLですぐに抽出を行います。上部水相を収集します。 3 M酢酸ナトリウム(pH = 5.2)、グリコーゲン2.5~5μg、エタノール2.5~5~5~2.5~2.5~2.5~2.5~2.5~エタノールを添加し、DNAを沈殿させます。-20°Cで1時間、遠心分離機を15分間13,000xg、4°Cでgインキュベートします。上清を捨て、1mLの冷たい70%エタノールでペレットを短時間洗います。 DNA/グリコーゲンペレットをスピードバックまたはエアドライで5分間乾燥させます。 ペレットを10 mMトリス-HCl(pH = 7.5)の50 μLに溶かします。メーカーの指示に従って調製したストレプトアビジン磁気ビーズを5 μL加え、できればカルーセルミキサーまたは穏やかな渦で1時間混合します。 磁気スタンドでビーズを分離し、ビオチンなしでDNAに富んだ液体を収集します。 エタノール沈殿によってDNAを濃縮する(ステップ5.4~5.5)。 前工程の濃縮DNAを5μLの水に溶解し、F2およびR1プライマーとのPCR反応で鋳型として使用する(表1A)。注:テンプレート汚染の問題を回避し、PCR アーティファクトを最小限に抑えるために、Taq ポリメラーゼ (Pfu または Phusion ではない) を使用し、テンプレート サイズ (1 kb = 1 分) に比例した延長時間で 18 ~ 20 サイクルを実行します (表 2Bを参照)。 アガロースゲルでPCR産物を分画し、期待サイズの製品を切り取ります。一部のスミアは、異なるサイズの製品があることを示します(図6を参照)。ゲルスラブからDNAを市販キットで精製します。 ステップ 5.10 から最大 50 ng の DNA と、ステップ 5.9 と同じプロトコルを使用してプライマー F1 および R2 を使用して、2 番目の PCR 反応を実行します。5.10に記載された製品の精製を進めます。アガロースゲルデンシソメトリー(UV分光法ではない)による定量後の精製DNAは、次のインビトロ選択のラウンドで使用することができる(ステップ4.6)。 6. 変更された順序特異性の画面バリアント 選択したバリアントを複製します。 ORFのクローニングに適した制限酵素の10 Uで2時間のステップ5.10から製品を消化し、酵素ベンダーが推奨する温度とバッファーで発現ベクター(NlaIV:NcoIおよびXhoIの場合) にします。アガロースゲル電気泳動で製品を解決し、予想サイズの断片を分離します。 プラスミドベクター(例えば、pET28)をステップ6.1.1と同じ酵素で二重切断して調製し、製品を市販のDNAゲル精製キットでゲル精製します。 アガロースゲル電気泳動による濃度測定により、ベクターおよびインサートの濃度を推定します。 T4 DNAリガーゼとベクターの1〜5 Uでライゲーションを設定:酵素ベンダーが推奨する1xリガーゼバッファーの1:3〜1:5のモル比を挿入します。RTで2時間インキュベートし、変換またはエレクトロポレーション12によって適切な宿主細菌(ステップ1.3から)に導入する。 適切な抗生物質(pET28またはpET30ベクターの場合は50μg/mLのカナマイシン)および1%グルコースを含むLBプレート上のエトランスタントを選択します。 発現タンパク質変異体。 単一コロニーをトランスフォーメーションから単一コロニー(1回の実行で簡単に処理できる)から、2mLのLBにカナマイシン(50μg/mL)、1%グルコースを加え、37°Cで一晩揺れで成長させます。 100 μg カナマイシンを含む 15 mL の暖かい (37 °C) LBを、一晩培養した 0.75 mL のブドウ糖を含み、激しく振るとともに 37 °C でインキュベートします。注:50 mL遠心分離管または100 mLエルレンマイヤーフラスコを使用することができます。 176 μLのグリセロールを一晩培養した1 mLに加える(グリセロールの最終濃度= 15%)十分に混ぜ、-70°Cで凍結してください。 2–3 h の後、15 mL の培養物(ステップ 6.2.1 から)、IPTG を 1 mM に、培養するとさらに 5 時間になります。 細菌ペレットを遠心分離(10,000 x g、4°C、10分)で回収し、-70°Cで凍結します。 g タンパク質変異体を精製します。 ニッケル親和性樹脂懸濁液20μLを、広いボアピペットチップを備えた1.5mLチューブ内のB1バッファの200μLに移し、穏やかに混ぜ、遠心g分離機(5,000 x g、30 s、4°C)を混合します。ピペットで上清を取り除き、チューブを氷の上に置いておく。 B1のステップ6.2.5から細菌ペレットを激しい渦を起こし、B1の300 μLで再懸濁する。サスペンションを1.5mLチューブに移します。 B1に100xプロテアーゼ阻害剤カクテルとリソソーム溶液を3μL加えます(最終濃度は1mg/mL)。先端装備のプローブと超音波処理によって細胞を崩壊させます。>15 s 先端冷却時間を間の氷で、サンプルごとに 6 つの 10 秒バーストを使用します。細胞懸濁液を常に氷の上に置いてください。 遠心分離(2分、12,000 x g、4°C)によるgペレット細胞デブリス、およびステップ6.3.1から樹脂アリコートに250μLの上清を移す。 冷たい部屋で15分間混ぜ、好ましくはカルーセルミキサーで、または穏やかな渦によって。 遠心分離機(5,000xg、30s、4°C)とピペットで上清を吸引する。 g 500 μL の W バッファーを加え、樹脂を緩やかに再懸濁します。遠心分離機(5,000xg、30s、4°C)とピペットで上清を吸引する。 g ステップ 6.3.7 を繰り返します。 バッファーEを20μL加え、静かに樹脂を再懸濁し、試料を2~5分間氷上に置いて、遠心分離機(5,000 x g,30s,4°C)を残し、上清を回収します。 ステップ 6.3.9 を繰り返します。プール上清。 SDS-PAGE(5-10 μL)でタンパク質サンプルを分析する(図7)。 特殊性が変更されたバリアントの画面。 バクテリオファージラムダDNAに対するアッセイ切断活性。タンパク質サンプルは、最終反応量の最大10%を構成することができます。0.5 μgのDNAおよび2時間の反応時間あたりの合計2 μLのタンパク質サンプルが良い出発点です。 アガロースゲル電気泳動による反応生成物と、野生型酵素によって生成された生成物を分析します。更なる分析のために野生型酵素によって生成されたものと明確に区別できる切断パターンを生成するクローンを選択する(図8)。