האבולוציה בבימויו של הגבלת מגבלות על הגבלה עם ספציפיות יותר מחמירות

1. הכנת ESCs שיבוט מתילאז של מערכת שינוי ההגבלה להיות מהונדס מספר עותק נמוך פלמיד (למשל, pACYC184 או pACYC174 או נגזרות שלהם).הערה: זן מארח חיידקי חייב להיות מסוגל לסבול מתילציה הציג על ידי האנזים משוכפל ולספק inducible ביטוי של T7 RNA פולימראז. מומלץ להשתמש בER2566 המאמץ (הנושא בממסים, McrBC ומוטציות Mrr). לאשר את ה-DNA רקומביננטי באמצע מוגן מפני המחשוף על ידי endgnate החוזה על ידי טיפול 0.5 μg של ה-DNA באמצע עם 10 יחידות קנצוני ושהה במאגר ובטמפרטורה מומלץ על ידי ספק האנזים עבור 2 h. להכין תאים מוכשרים של זן זה.הערה: ניתן להשתמש בכל שיטה. פרויקט ההנדסה NlaIV השתמש בשיטת סידן כלוריד פשוטה12. בניית רקומביננטי פלמיד עם ORF עבור ושהה תחת שליטה של היזם T7 מקבוצת הדרה שונה עם סמן בחירה שונה מאשר אחד המכיל את הגן מתילsferase בשלב 1.1. וקטורים pET28 ו-pET30 ניתן להשתמש. הסר את כל אתרי הזיהוי עבור האנזים הנדסה מתוך הקטע של הרקומביננטי פלבין T7 היזם ולהפסיק קודון של האנזים orf על ידי החדרת מוטציות שתיקה (איור 2, טבלה 1a).הערה: אם יש להסיר יותר מאתר אחד כזה, מספר סיבובים של מוטציות יהיו נחוצים (שלבים 1.5.1 – 1.5.7). השתמש בתגובת PCR מבפנים המגבירה את הפלביניים באורך מלא עם וריאציות מעוצבות שהוצגו בקצה 5 של התחל (שולחן 2A). הסר את ה-DNA של התבנית על-ידי הוספת 10 U של DpnI endonחכירה ל-50 μL של תגובת ה-PCR, ו-הדגירה עבור 2 h ב 37 ° c. לפתור את המוצרים על ידי אגנה ג’ל אלקטרופורזה. חותכים את הלהקה המתאימה לפלבאמצע באורך מלא ומטהר אותה בערכה מסחרית. הוסף מאגר הקשר של 10x (לריכוז של 1 x) והוסף עם ATP (עד 1 מ”מ). הוסף 10 U של T4 polynucleotide קינאז ו הדגירה עבור 20 דקות ב 37 ° c. הפוך את האנזים על ידי חימום ב 70 ° c עבור 10 דקות. הוסף פג 4000 כדי 5%, תוספת שוב עם ATP (כדי 1 מ”מ), ולהוסיף 5 U של T4 ligase DNA. דגירה עבור 2 h בטמפרטורת החדר (RT). להפוך זן חיידקי מוסמך נושאת קנצוני מתילאז (שלב 1.1). בודד את ה-DNA הפלמיד בקנה מידה קטן ולאשר את המבוא של שינויי רצף על ידי רצפי dideoxy. הצגת אתרי הגבלה ייחודיים בקרבת הרצף (ים) המיועדים להגבלת מוטאוזיס (איור 2, טבלה 1b). בצע את השלבים 1.5.1 – 1.5.7 עבור כל אתר.הערה: שלב זה מבוצע רק כאשר נעשה שימוש במוטגנזה ממוקדת. אם ביצוע מוטזיס אקראי, דלג על שלבים 2-3 והמשך לסעיף 3 במקום. בדוגמה המוצגת, כל האתרים הוכנסו במעלה הזרם של האזורים המיועדים, אך ניתן להציג אותם גם במורד הזרם. עיצוב התחל עבור הגברה של ESC (שולחן 1C). לעצב כריכה לאחור הכריכה של orf endonuclease, אשר יציג את אתר הזיהוי הנבחר (R1) ואת הגירסה הקצרה שלה (R2) הנקשר מחוץ לרצף nlaiv שנבחרו ומכיל ביוטין בסוף 5 ‘ (ראה איור 1). עצב כריכת תחל (F1) לתוך ESC במעלה הזרם של מקדם T7. פריימר זה צריך גם להציג משתנים שנבחרו נגד (s) של רצף הזיהוי המקורי (כלומר, את המקסימום של וריאציות רצף מזוהה על ידי האנזים המקורי למעט רצף הפוכה שנבחרו).הערה: גרסה קצרה יותר של פריימר זה (F2) כי מכסה את הרצף של הרצף הבחירה הנבחרת יהיה להשתמש מאוחר יותר ב-PCR סלקטיבי (שלב 5.9). 2. הסינתזה המפוצלת והמיקס של הכוונת התחל הערה: שלב זה משמש רק עבור פרוייקטים המחייבים מוטארזיס תת-רוויה ביותר מאתר אחד. דרוש סינתיסייזר עם מספר עמודות סינתזה. הקצאת עמודות עבור סינתזה של nns אקראי שלישיות ו סוג פראי קודון שלישיות על פי תדרי מוטגנזה. לדוגמה, אם מדובר בשבעה עמודות שוות לסינתזה של אמצעי אחסון, וקצב מוטארסיס של 0.3 רצוי באתר נתון, הוסף מרכיבי NNS אקראיים בתוך ~ 0.3 x 7 או 2 עמודות, ומסוג פראי של מרכיבי הכתב ב ~ 0.7 x 7 או 5 עמודות (איור 3). החלט אודות אתרים עבור מוטארסיס לרוויית משנה. בחר בתדרי מוטזיס בהתאם לחשיבות ההיפוזתית של האתרים (דהיינו, ככל שהאתר חשוב יותר, כך התדירות גבוהה יותר), שמירה על מגבלות על המורכבות הכוללת של הספרייה (ראה דיון). סינתזה של מחלת היתר בכל העמודות, עד לתחילת הטריזתן מייד לפני האתר השני של מוטאוזיס שונה בספירה של 3-end. אין להסיר את ההגנה של 5 ‘-טריטיל במחזור הסינתזה האחרון (השתמש באפשרות trityl על הסינתיסייזר). קבוצת ההגנה תוסר בתחילת מחזור הסינתזה הבא (שלב 1 באיור 3). פתח את עמודות הסינתזה. לאסוף זכוכית נקבובית מבוקרת (ה-CPG) תמיכה סינתזה לתוך צינור יבש 1.5 mL ומערבבים על ידי vortexing. למחיצות מחדש את שרף ה-CPG המעורב לתוך עמודי סינתזה חדשים. הימנע להציג לחות, כי היא תפחית את התשואה הכוללת (שלבים 2 ו-4 באיור 3). המשך בסינתזה, החל מהמוטאוזיס שלישיה באתר. הקצאת עמודות שלישיות NNS אקראי או שלישיות סוג פראי בהתאם לתדר מוטארסיס הרצוי (ראה הערה לעיל). אם קיימים אתרי רוויית משנה נוספים, המשך רק לנקודת הכשל לפני האתר השני של מוטבי הרוויה הבאה. שוב, להשאיר קבוצה של 5 ‘-טריטיל על בסוף (5 ‘-טריטיל על הסינתיסייזר) (שלב 3 באיור 3). לאחר מכן המשך בשלב 2.3. אם אין יותר אתרי הרוויה מופיע במורד הזרם, להשלים את הסינתזה, להשאיר קבוצה 5 ‘-trityl בסוף (5 ‘-הטריטיל-על הסינתיסייזר) (שלב 5 באיור 3). הגנה על הספריה וטיהור הספרייה על פי הוראות יצרן מחסנית הטיהור.הערה: מחלת הלחות של ה-CPG ניתן גם לטהר את השלב ההפוך ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (בדיקות) עם טריטיל-מופעל ואחריו הסרת קבוצת טריטיל ידני (1 h טיפול עם 80% חומצת חומץ ב-RT) וטיהור שנייה. בדוק את איכות הספרייה הנוספליונואומית בג עמוד שתנן. 3. יצירת ספריות משתנה הערה: השתמש ברקומביננטי פלמיד משלב 1.6. צור את הספריות על-ידי הפעלת מוטאוזיס מכוון.הערה: לחלופין, השתמש בפרוטוקול EP-PCR (שלב 3.2). הגבר קטע מיזם T7 לאתר האנזים ההגבלה הייחודי החוצה את הרצף המיועד עם מוטגנזה (במקרה של NlaIV: סאלי, EcoRI, או Eco52I) (שולחן 1b-C, שולחן 2b, איור 4). הקצה את החלק השני מאתר האנזים ההגבלה הייחודי לסוף ה-3 של ESC. מערבבים בנפרד 5 μL של תגובות ה-PCR (משלב 3.1.1) עם 8 μL של מים, 1.5 μL של מאגר אנזים הגבלה של 10x, ו-5 יחידות של אנזימי הגבלה מתאימים (סאלי, EcoRI, או Eco52I) ו-דגירה בטמפרטורה המתאימה עבור 2 h. לפתור את המוצרים של שתי התגובות באמצעות האלקטרופורזה ג’ל אגנה. חותכים את הרצועות בגודל המצופה ומטהרו את הערכה המסחרית. לרוץ עד 1/3 של מוצרים מטוהרים בג agarose ולמדוד את הריכוז של כל להקה מטוהרים על ידי densi, try. להגדיר את הקשר של שני חלקים של escs ביחס טוחנת 1:1 עם מאגר ליגאז 1x ו-1 U של T4 ליגאז ה-DNA ו-דגירה עבור 2 h ב RT. לפתור את מוצרי התגובה של ג’ל agarose. גזור את המוצרים בגודל הצפוי ולטהר עם ערכה מסחרית. מגבירים את המוצרים המטוהרים בתגובת PCR עם התחל F1 ו-R2 (שולחן 1C ושולחן 2a). אין להפעיל יותר מ-20 מחזורי הגברה. אנגיופלסטיקה את התגובות ה-PCR בג’ל שנוצר. גזור את המוצרים ולטהר עם ערכת מסחרית. הפעל 5 μl סדרת מחלקים של הספרייה מטוהרים מהשלב הקודם של agarose ג’ל ולמדוד את הריכוז על ידי densi, try. שיבוט מדגם קטן של הספרייה (עד 5 μL) ורצף > 15 שיבוטים כדי לבדוק את תדר מוטציה והפצה (שולחן 3). . המשך לשלב 4הערה: לחילופין, ניתן להשתמש ברצף התפוקה הגבוהה של המדגם הקטן של ה-ESCs. בצע EP-PCR. להגביר את ESC מתוך הפלס1 שהתקבל בשלב 1.5.7 עם התחל F1 ו R1. הפעל 20 מחזורים עם Taq I פולימראז (שולחן 1B). ג’ל מטהר את מוצר ה-PCR. הגדר את EP-PCR עם 2 מוצרים של מוצר PCR מטוהר מהשלב הקודם והפעל 15 מחזורים של EP-PCR (טבלה 1C) עם התחל F1 ו R1. ג’ל לטהר את המוצר ולכמת אותו על ידי ג’ל densi, try.הערה: בשל ריכוז נמוך של השימוש מוצר EP-PCR מטוהרים על 1/3 לכמת. שיבוט מדגם קטן של הספרייה (עד 1/5) ורצף > 15 שיבוטים כדי לבדוק את תדר המוטציה והפצה (שולחן 4).הערה: לחילופין, בצע רצף תפוקה גבוהה של המדגם הקטן של ESCs. 4. ביצוע מידור בתמלול חוץ גופית-תגובת תרגום בדיקת הביטוי endonuclease ופעילות אנזימטית ב תמלול, תרגום. להכין המצע קצר (200-500 bp) עם אתר זיהוי יחיד עבור endonuclease הממוקם קרוב למרכז המולקולה כך תגובת המחשוף ניתן לזהות בקלות.הערה: הדרך הקלה ביותר להכין את המצע היא על ידי PCR הגברה של שבר מתאים של כל מולקולה DNA. המצע יכול להיות רדיויניום או מסומן בצורה מסודרת כדי לפשט את זיהוי המחשוף. הגדר את 50 μL של תגובת תמלול-תרגום עם 0.5 μg של בחור סוג של ESC בהתאם להמלצות של היצרן. להוסיף מלח מגנזיום (MgCl2, mgcl4, ואצטט מגנזיום ניתן לבדוק) כדי 1.5 mM ואת הכמות המתאימה של מצע מהשלב הקודם (לפחות 0.5 ΜG במקרה של DNA ללא תווית).הערה: כל שעתוק/ערכת תרגום שאינו מכיל נוקלאז המופעל על ידי מגנזיום ניתן להשתמש. חלק מספקי הקיט משתמשים בנוקלאוסים כדי להסיר את זיהום ה-DNA במהלך ההפקה ולאחר מכן להוסיף כבדים כמעכבי נוקלאז. ערכות כאלה אינן תואמות לשיטה זו. מודמת את תגובת התרגום לפי הוראות היצרן. ואז להעביר את תערובת התגובה לטמפרטורה אופטימלית עבור אנזים ההגבלה עבור 2 h. לנתח את המחשוף של המצע ב-agarose ג’ל ואחריו זיהוי מתאים (למשל, כתמים DNA, הדמיית זריחה, או אדיגרפיה אוטומטית) (איור 5).הערה: לפחות מחשוף חלקי של המצע הכרחי לפני שתמשיך עם מידור. אם זה לא מושגת, אופטימיזציה נוספת של הצורה הכימית מגנזיום או הריכוז שלה הוא הכרחי. להכין תערובת שמן surfactant על ידי הוספת 225 μL של Span 80 ו 25 μL של רצף ה80 כדי 5 מ ל של שמן מינרלי ב 15 מ”ל צינור חרוט. מערבבים ביסודיות על ידי היפוך עדין של הצינור 15x. עבור כל העברת ספריה 950 μL של תערובת שמן surfactant ל 2 mL עגול התחתון בקבוקון הקריוגני, תווית עם שם ספרייה, ולהעביר לקרח. שים אחד קטן לערבב גליל פס (5 x 2 מ”מ2) לתוך כל בקבוקון. להכין שעתוק מחוץ למבחנה-תגובת התרגום תערובת (50 μL עבור כל ספריה) על פי הצעות היצרן. מוסף את התערובת עם מגנזיום כלוריד לריכוז הסופי של 1.5 מ”מ (ראה שלב 4.1.4). מדבקות 50 μL למטה לתוך 1.5 מנורות mL על הקרח. הוסף 1.7 fmole של הספרייה (מסעיף 3) לתערובת התגובה על קרח.הערה: אין להשתמש בכמות גדולה יותר של ספריית ביטויים ליעילות בחירה. חשוב למזער את התדירות של טיפות מימית המכילות יותר ממולקולה DNA אחת. הכינו תחליב מים בשמן ברציפות לכל ספריה. שים בגביע קטן (או גביע גדול בקבוק) מלא קרח על מערבב מגנטי עם מהירות ערבוב להגדיר ב 1,150 rpm. העבר בקבוקון קריוגני עם 950 μL של תערובת שמן surfactant, בר ערבוב קטן משלב 4.3 לגביע קר קרח על מערבב מגנטי. בדוק כי בר ערבוב מסתובב. הוסף 5 10 μL ali, s של ספריית מבחנה-שעתוק-תרגום תערובת על ידי תקופה של 2 דקות במרווחי זמן של 30 ולהמשיך ערבוב לדקה נוספת. העבר את המבחנה עם אמולסיה למיכל קרח. המשך בספריה הבאה המתחילה בשלב 4.7.2. לאחר שכל הספריות מעובדות, התחל את הדגירה של כל הספריות בהתאם להמלצות של יצרן הערכה. העבר את הבקבוקונים לטמפרטורה אופטימלית עבור endonuclease הנדסה עבור 2 h נוספים ולאחר מכן לשים אותם על הקרח לפחות 10 דקות. 5. המשך עיבוד הספריות והבחירה העבר את האמולסיות מצלוחיות הקריוגניים לצינורות הקרים 1.5 mL, להוסיף 1 μL של 0.5 M EDTA ו צנטריפוגה אותם ב 13,000 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר את שלב הנפט העליון עם פיפטה. אם השלב הפנימי של מי הנפט אינו גלוי, הרכבת התחתית עבור לפחות 5 דקות ב-20 ° c כדי להקפיא את השלב מימית, ואז מיד ללטף את שלב הנפט הנוזלי. הוסף 100 μL של 10 mM הHCl Tris pH 8.0 ומיד לבצע החילוץ עם 150 μL של פנול: כלורופורם (1:1 v/v) על ידי vortexing קצר ואחריו הפרדת הפאזה על ידי 30 s צנטריפוגה ב 13,000 x g. לאסוף את השלב העליון מימית. מזרז את ה-DNA על ידי הוספת 0.1 vol (15 μL) של 3 M אצטט נתרן (pH = 5.2), 2.5 – 5 μg של גליקוגן ו 2.5 vol (375 μL) של אתנול. דגירה ב-20 ° c עבור 1 h ו צנטריפוגה עבור 15 דקות ב 13,000 x g, 4 ° c. להיפטר supernatant ולשטוף בקצרה את הגלולה עם 1 מ ל של הצטננות 70% אתנול. יבש את ה-DNA/כפות הגליקוגן ב speedvac או באוויר יבש עבור > 5 דקות. לפזר את הגלולה ב 50 μL של 10 מ”מ טריס-HCl (pH = 7.5). הוסף 5 μL של חרוזים מגנטיים streptavidin שהוכנו על פי הוראות היצרן ולערבב עבור 1 h ב RT, רצוי במיקסר קרוסלה או על ידי וורטקנג עדין. הפרידו את החרוזים על דוכן מגנטי ואספו את הנוזל המועשר ב-DNA ללא biotin. רכז את הדנ א על ידי משקעים אתנול (שלבים 5.4 – 5.5). לפזר את ה-DNA מרוכז מהשלב הקודם ב 5 μL של מים ולהשתמש כתבנית ב-PCR התגובה עם F2 ו R1 התחל (שולחן 1A).הערה: כדי למנוע בעיות עם זיהום התבנית ולמזער את הממצאים החזותיים להשתמש Taq פולימראז (לא Pfu או Phusion) ולהפעיל 18 – 20 מחזורים עם זמן הארכה פרופורציונלי לגודל התבנית (1 kb = 1 דקות) (ראה טבלה 2B). האנגיופלסטיקה את מוצר ה-PCR בג והוציא את מוצר הגודל הצפוי. חלק מהפסולת מצביעה על כך שישנם מוצרים בגדלים שונים (ראו איור 6). לטהר את ה-DNA מלוח הג עם ערכת מסחרית. הפעל תגובת PCR שנייה עם עד 50 ng של ה-DNA משלב 5.10 התחל F1 ו-R2 באמצעות אותו פרוטוקול כמו בשלב 5.9. המשך עם טיהור המוצר כפי שמתואר ב-5.10. דנ א מטוהרים לאחר כימות על ידי agsi, ג’ל הדנטונסה (לא ספקטרוסקופיית UV) ניתן להשתמש בסיבוב הבא של בחירת מבחנה (שלב 4.6). 6. משתני מסך עבור שינויים ברצף ספציפיות שיבוט משתנים שנבחרו. לעכל את המוצר משלב 5.10 עבור 2 h עם 10 U של אנזימים הגבלה מתאים שיבוט של ORF לתוך וקטור הביטוי (עבור NlaIV: Nlaiv ו XhoI) בטמפרטורה ומאגר מומלץ על ידי ספק האנזים. לפתור את המוצרים עם אלקטרופורזה ג’ל agarose ולבודד את מקטע הגודל הצפוי. הכינו את וקטור הפלמיד (למשל, pET28) על ידי מחשוף כפול עם אנזימים זהים כמו בשלב 6.1.1 ו ג’ל לטהר את המוצר עם ערכת הטיהור ג’ל מסחרי של ה-DNA. להעריך את ריכוזי וקטור ולהוסיף על ידי densi, try עם agarose ג’ל אלקטרופורזה. הגדרת הקשר עם 1 – 5 של T4 לליגאז DNA ו וקטור: להוסיף יחס טוחנת 1:3 – 1:5 במאגר 1x ליגאז מומלץ על ידי ספק האנזים. דגירה עבור 2 h ב RT ולהציג לתוך חיידקים מארחים המתאים (משלב 1.3) על ידי שינוי או אלקטרופורציה12. בחר extransformants על לוחות LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה (50 μg/mL של kanamycin עבור pET28 או pET30 וקטורים) ו 1% גלוקוז. . משתני חלבון מהירים אינומאז מושבות יחיד מן השינוי (עד 24 שיבוטים ניתן לעבד בקלות בריצה אחת) לתוך 2 מ ל ליברות עם kanamycin (50 μg/mL) ו 1% גלוקוז ולצמוח לילה ב 37 ° צ’ עם רעד. האיחסן 15 מ ל חם (37 ° c) ליברות המכילה 100 μg kanamycin ולא גלוקוז עם 0.75 mL של התרבות לילה ו הדגירה ב 37 ° צ’ עם טלטול נמרץ.הערה: או 50 mL שפופרות צנטריפוגה או 100 mL מבחנות Erlenmayer ניתן להשתמש. הוסף 176 μL של גליצרול עד 1 מ ל של תרבות לילה (ריכוז סופי של גליצרול = 15%) לערבב היטב ולהקפיא ב-70 ° c. לאחר 2 – 3 h תוספת של 15 מ ל של התרבות (משלב 6.2.1) עם IPTG ל 1 מ”מ ותרבות עבור תוספת של 5 h. לאסוף את הגלולה חיידקים על ידי צנטריפוגה (10,000 x g, 4 ° צ’, 10 דקות) ו להקפיא ב-70 ° c. . טהר את משתני החלבון העברה 20 μL של ניקל מתלה שרף הבולם לתוך 200 μL של מאגר B1 בצינור 1.5 mL עם טיפ רחב מנשא פיפטה, לערבב בעדינות, צנטריפוגה (5,000 x g, 30 s, 4 ° c). הסר את הסופרנטנט על ידי מלטף והשאר את השפופרת על הקרח. השהה מחדש את הגלולה החיידקית משלב 6.2.5 ב-300 μL של B1 על-ידי vortexing נמרץ. להעביר את ההשעיה לתוך צינור 1.5 mL. הוסף 3 μl של קוקטייל מעכב פרוטאז 100x ופתרון ליזוזום ב B1 (הריכוז הסופי של 1 מ”ג/mL). לפירוק התאים על ידי sonication עם הלווין מצויד המכשיר. השימוש 6 10 s צרורות לכל מדגם עם > 15 s זמן קירור בקרח בין. . לשמור על השעיות בקרח כל הזמן גלולה פסולת תא על ידי צנטריפוגה (2 דקות, 12,000 x g, 4 ° c) ו העברה 250 μl של סופרנטאנט שרף משלב 6.3.1. מערבבים עבור 15 דקות בחדר קר, רצוי במיקסר קרוסלה או על ידי הורטקנג עדין. צנטריפוגה (5,000 x g, 30 s, 4 ° c) ומכה את הסופרנטאנט עם פיפטה. הוסף 500 μL של מאגר W והשהה מחדש בעדינות את השרף. צנטריפוגה (5,000 x g, 30 s, 4 ° c) ומכה את הסופרנטאנט עם פיפטה. חזור על שלב ה6.3.7. הוסף 20 μL של מאגר E, השהה מחדש בעדינות את השרף, והשאר את המדגם על קרח עבור 2 – 5 דקות. צנטריפוגה (5,000 x g, 30 s, 4 ° c). ותאסוף את הסופרנטאנט חזור על שלב ה6.3.9. . בריכת-על ניתוח דגימות חלבונים ב-SDS-עמוד (5 – 10 μL) (איור 7). מסך עבור משתנים עם ספציפיות משתנה. שיטת מחשוף פעילות על בקטייאג DNA למדא. דגימת החלבון יכולה להוות עד 10% מנפח התגובה הסופי. סך של 2 μL של דגימת חלבון לכל 0.5 μg של ה-DNA ו 2 זמן התגובה היא נקודת התחלה טובה. לנתח את מוצרי התגובה על ידי אגקם אלקטרופורזה ג’ל יחד עם המוצרים שנוצרו על ידי האנזים סוג פראי. בחר את המשובטים היוצרות דפוסי המחשוף להבדיל בבירור מן האחד שנוצר על ידי אנזים סוג פראי לניתוח נוסף (איור 8).