In Vitro Gerichte Evolutie van een beperking Endonuclease met strengere specificiteit

1. Voorbereiding van de SER’s Kloonmethyltransferase van het restrictie-modificatiesysteem dat moet worden ontworpen in een laag kopieernummer plasmide (bijvoorbeeld pACYC184 of pACYC174 of derivaten daarvan).LET OP: De bacterieel gastheerstam moet methylatie kunnen verdragen die door het gekloonde enzym wordt geïntroduceerd en een induceerbare expressie van T7 RNA polymerase kunnen bieden. Gebruik van de ER2566 stam (met McrA, McrBC, en MRR mutaties) wordt aanbevolen. Bevestig dat het recombinante plasmient-DNA wordt beschermd tegen decolleté door de cognate endonuclease door 0,5 μg plasmid-DNA te behandelen met 10 eenheden cognate REase in buffer en temperatuur aanbevolen door de enzymleverancier gedurende 2 uur. Bereid competente cellen van deze stam voor.LET OP: Elke methode kan worden gebruikt. Het NlaIV engineering project maakte gebruik van een eenvoudige calciumchloride methode12. Bouw recombinant plasmide met de ORF voor de REase onder controle van de T7 promotor uit een andere uitsluitingsgroep en met een andere selectie marker dan degene die het methyltrasferase gen in stap 1.1. Vectoren pET28 en pET30 kunnen worden gebruikt. Verwijder alle herkenningsplaatsen voor het gemanipuleerde enzym uit het gedeelte van de recombinante plasmide tussen de T7-promotor en de stopcodon van het enzym ORF door stille mutaties in te voeren (figuur 2,tabel 1A).OPMERKING: Als meer dan één dergelijke locatie moet worden verwijderd, zijn meerdere mutatierondes nodig (stappen 1.5.1–1.5.7). Gebruik een inside-out PCR-reactie die het plasmide over de volledige lengte versterkt met ontworpen variaties die aan de 5′ uiteinden van de primers (Tabel 2A)worden geïntroduceerd. Verwijder het sjabloon-DNA door 10 U DpnI endonuclease toe te voegen aan de 50 μL van de PCR-reactie en in te broeden gedurende 2 uur bij 37 °C. Los de producten op met agarose gel elektroforese. Knip de band die overeenkomt met de volledige lengte plasmide en zuiveren met een commerciële kit. Voeg 10x ligatiebuffer (tot een 1x concentratie) toe en vul aan met ATP (tot 1 mM). Voeg 10 U van T4 polynucleotide kinase toe en incubeer gedurende 20 min bij 37 °C. Activeer het enzym door het enzym gedurende 10 min bij 70 °C te verwarmen. Voeg PEG 4000 tot 5% toe, vul opnieuw aan met ATP (tot 1 mM) en voeg 5 U van T4 DNA ligase toe. Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur (RT). Transformeer in een competente bacteriële stam die cognate methyltransferase draagt (stap 1.1). Isoleer het plasminiet-DNA op kleine schaal en bevestig de introductie van sequentieveranderingen door dideoxy sequencing. Unieke beperkingsplaatsen in de buurt van de sequentie(s) die het doelwit zijn van oligonucleotide geleide mutagenese (figuur 2, tabel 1B). Volg de stappen 1.5.1–1.5.7 voor elke site.LET OP: Deze stap wordt alleen uitgevoerd wanneer een gerichte mutagenese wordt gebruikt. Als u willekeurige mutagenese doet, slaat u stap 2-3 over en gaat u in plaats daarvan verder met sectie 3. In het gepresenteerde voorbeeld werden alle locaties stroomopwaarts van de beoogde regio’s geïntroduceerd, maar ze kunnen ook stroomafwaarts worden ingevoerd. Ontwerpprimers voor de versterking van de ESC (tabel 1C). Ontwerp een omgekeerde primerbinding stroomafwaarts van de endonuclease ORF die de geselecteerde herkenningssite (R1) en de kortere versie (R2) introduceert die buiten de geselecteerde NlaIV-sequentie bindt en biotine aan het 5′-einde bevat (zie figuur 1). Ontwerp een forward primer (F1) binding aan de ESC stroomopwaarts van de T7 promotor. Deze inleiding moet ook tegengeselecteerde variant(s) van de oorspronkelijke herkenningsreeks introduceren (d.w.z. het maximum aan sequentievariaties dat door het oorspronkelijke enzym wordt herkend, met uitzondering van de geselecteerde omgekeerde sequentie).LET OP: Een kortere versie van deze primer (F2) die de volgorde distaal aan de tegengeselecteerde volgorde dekt zal later worden gebruikt in de selectieve PCR (stap 5.9). 2. Split-and-mix synthese van mutagene primers LET OP: Deze stap wordt alleen gebruikt voor projecten waarvoor subverzadigingmutagenese op meer dan één locatie nodig is. Een synthesizer met meerdere synthesekolommen is vereist. Wijs kolommen toe voor synthese van gerandomiseerde NNS codon drieling en wilde type codon drieling volgens de mutagenese frequenties. Als er bijvoorbeeld zeven synthesekolommen met een gelijk volume beschikbaar zijn en een mutagenesesnelheid van 0,3 wenselijk is op een bepaalde locatie, voegt u gerandomiseerde NNS-codons toe in ~ 0,3 x 7 of twee kolommen en wilde typecodons in ~ 0,7 x 7 of vijf kolommen (figuur 3). Beslis over sites voor subverzadiging mutagenese. Kies mutagenese frequenties op basis van het hypothetische belang van de sites (dat wil zeggen, hoe belangrijker de site, hoe hoger de frequentie), het houden van grenzen aan de algehele complexiteit van de bibliotheek in het achterhoofd (zie Discussie). Synthetiseer oligonucleotiden in alle kolommen, tot de triplet onmiddellijk voorafgaand aan de tweede subverzadiging mutagenese site tellen van de 3′-end. Verwijder de 5’trityl beschermende groep niet bij de laatste synthesecyclus (gebruik de trityl-on optie op de synthesizer). De beschermgroep wordt aan het begin van de volgende synthesecyclus verwijderd (stap 1 in figuur 3). Open de synthesekolommen. Verzamel gecontroleerde porieglas (CPG) synthese ondersteuning in een droge 1,5 mL buis en meng door vortexing. Herverdeling van de gemengde CPG hars in nieuwe synthese kolommen. Vermijd de invoering van vochtigheid, omdat het de totale opbrengst zal verminderen (stappen 2 en 4 in figuur 3). Doorgaan synthese, te beginnen met de subverzadiging mutagenese site triplet. Wijs kolommen toe aan gerandomiseerde NNS-drieling of wilde typedrieling volgens de gewenste mutagenesefrequentie (zie opmerking hierboven). Als er extra subverzadigingsplaatsen aanwezig zijn, gaat u alleen verder naar de triplet voorafgaand aan de volgende subverzadigingsmutagenesesite. Nogmaals, laat een 5’trityl groep op aan het einde (5′-trityl-on optie op de synthesizer) (stap 3 in figuur 3). Ga dan verder met stap 2.3. Als er niet meer subverzadiging sites aanwezig zijn stroomafwaarts, vul de synthese, waardoor een 5’trityl groep aan het einde (5′-trityl-on optie op de synthesizer) (stap 5 in figuur 3). Debescherm en zuiver de oligonucleotide bibliotheek volgens de instructies van de fabrikant van de zuiveringscartridge.LET OP: Oligonucleotiden die vrijkomen door onteigening tegen de CPG kunnen ook worden gezuiverd in de omgekeerde fase high performance liquid chromatografie (HPLC) met trityl-on gevolgd door een handmatige trityl groep verwijdering (1 uur behandeling met 80% azijnzuur bij RT) en een tweede HPLC zuivering. Controleer de kwaliteit van de oligonucleotidebibliotheek in een urerea-PAGE gel. 3. Variantbibliotheken genereren LET OP: Gebruik de recombinante plasmide van stap 1.6. Genereer de bibliotheken door oligonucleotide gerichte mutagenese.OPMERKING: Gebruik ook het EP-PCR-protocol (stap 3.2). Versterk een sectie van de T7-promotor tot de unieke beperkingsenzymsite die de met mutagenese gerichte sequentie flankeert (in het geval van NlaIV: SalI, EcoRI of Eco52I) (Tabel 1B-C, Tabel 2B, figuur 4). Versterk het tweede deel van de unieke beperking enzym site aan de 3 ‘einde van de ESC. Meng afzonderlijk 5 μL van de PCR-reacties (vanaf stap 3.1.1) met 8 μL water, 1,5 μL van 10x-beperkingsenzymbuffer en 5 eenheden van de juiste beperkingsenzymen (SalI, EcoRI of Eco52I) en incubeer bij de juiste temperatuur gedurende 2 uur. Los de producten van beide reacties op met behulp van agarose gel elektroforese. Knip de verwachte grootte banden en zuiveren met een commerciële kit. Loop tot 1/3 van de gezuiverde producten in een agarose gel en meet de concentratie van elke gezuiverde band door densitometry. Stel de ligatie van twee delen van de SER’s in een 1:1 kiesverhouding met 1x ligase buffer en 1 U van T4 DNA ligase en incubeer voor 2 uur bij RT. Los de reactieproducten op in de agarosegel. Knip de verwachte grootte producten en zuiveren met een commerciële kit. Versterk de gezuiverde ligatieproducten in een PCR-reactie met primers F1 en R2(tabel 1C en tabel 2A). Voer niet meer dan 20 versterkingscycli uit. Fractioner de PCR-reacties in een agarosegel. Knip de producten uit en zuiver met een commerciële kit. Voer een 5 μL aliquot van de gezuiverde bibliotheek uit de vorige stap in de agarose gel en meet de concentratie door densitometry. Kloon een klein monster van de bibliotheek (tot 5 μL) en sequentie >15 klonen om de mutatiefrequentie en -verdeling te controleren (tabel 3). Ga naar stap 4.LET OP: Als alternatief kan een hoge doorvoersequencing van de kleine steekproef van de SER’s worden gebruikt. EP-PCR uitvoeren. Versterk de ESC uit de plasmide verkregen in stap 1.5.7 met primers F1 en R1. Voer 20 cycli uit met Taq I polymerase(tabel 1B). Gel zuivert het PCR-product. Stel EP-PCR in met 2 ng gezuiverd PCR-product uit de vorige stap en voer 15 cycli EP-PCR(Tabel 1C)uit met F1- en R1-primers. Gel zuivert het product en kwantificeert het door geldenitometry.LET OP: Vanwege de lage concentratie van het gezuiverde EP-PCR productgebruik ongeveer 1/3 voor kwantificering. Kloon een kleine steekproef van de bibliotheek (tot 1/5) en reeks >15 klonen om de mutatiefrequentie en -verdeling te controleren (tabel 4).LET OP: U ook een hoge doorvoersequencing uitvoeren van de kleine steekproef van de SER’s. 4. Uitvoeren van gecompartimenteerde In Vitro Transcriptie-vertaling Reactie Test endonuclease expressie en enzymatische activiteit in in vitro transcriptie-vertaling. Bereid een kort (200-500 bp) substraat voor met één herkenningsplaats voor de endonuclease die zich dicht bij het midden van het molecuul bevindt, zodat de decolletéreactie gemakkelijk kan worden gedetecteerd.LET OP: De eenvoudigste manier om het substraat voor te bereiden is door PCR-versterking van een geschikt fragment van elk DNA-molecuul. Het substraat kan worden gelabeld of fluorescerend gelabeld om de decolletédetectie te vereenvoudigen. Stel 50 μL van een transcriptie-vertaling reactie met 0,5 μg van wild type ESC volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Voeg magnesiumzout (MgCl2, MgSO4en magnesiumacetaat kan worden getest) toe aan 1,5 mM en de juiste hoeveelheid substraat uit de vorige stap (ten minste 0,5 μg in geval van ongelabeld DNA).LET OP: Elke transcriptie/vertaalkit die geen nuclease bevat die door magnesium wordt geactiveerd, kan worden gebruikt. Sommige kitleveranciers gebruiken nucleases om DNA-contaminatie tijdens de productie te verwijderen en vervolgens chelators toe te voegen als nuclease-remmers. Dergelijke kits zijn niet compatibel met deze methode. De transcriptie-vertaalreactie uitbroeden volgens de instructies van de fabrikant. Breng vervolgens het reactiemengsel gedurende 2 uur over op de optimale temperatuur voor het beperkingsenzym. Het decolleté van het substraat in een agarosegel analyseren, gevolgd door passende detectie (bijvoorbeeld DNA-kleuring, fluorescentievisualisatie of autoradiografie) (Figuur 5).LET OP: Ten minste gedeeltelijke decolleté van het substraat is noodzakelijk alvorens verder te gaan met de compartimentering. Als dit niet wordt bereikt, is verdere optimalisatie van de magnesiumchemische vorm of de concentratie ervan noodzakelijk. Bereid een olie-oppervlakteactieve mengsel door 225 μL span 80 en 25 μL Tween 80 tot 5 mL minerale olie toe te voegen in een conische buis van 15 mL. Meng grondig door de buis 15x zacht om te keren. Breng voor elke bibliotheek 950 μL van het olie-oppervlakteactieve mengsel over naar een 2 mL ronde cryogene flacon, label met een bibliotheeknaam en overdracht naar ijs. Doe een kleine cilindrische roerstaaf (5 x 2 mm2)in elke flacon. Bereid een in vitro transcriptie-vertaling reactiemengsel (50 μL voor elke bibliotheek) volgens de suggesties van de fabrikant. Vul het mengsel aan met magnesiumchloride tot een eindconcentratie van 1,5 mM (zie stap 4.1.4). Geef 50 μL aliquots in 1,5 mL buizen op ijs. Voeg 1,7 fmole van de bibliotheek (vanaf sectie 3) toe aan het reactiemengsel op ijs.LET OP: Gebruik geen hogere hoeveelheid expressiebibliotheek voor selectie-efficiëntie. Het is van cruciaal belang om de frequentie van waterige druppels met meer dan één DNA-molecuul te minimaliseren. Bereid water-in-olie emulsie achtereenvolgens voor elke bibliotheek. Zet een kleine beker (of grote fles beker) gevuld met ijs op een magnetische roerr met de roersnelheid ingesteld op 1.150 rpm. Breng een cryogene flacon met 950 μL olie-oppervlakteactieve mengsel en een kleine roerstaaf van stap 4.3 over naar een ijskoud bekerglas op de magneetroerer. Controleer of de roerstaaf draait. Voeg vijf 10 μL aliquots van de in vitro bibliotheek-transcriptie-vertaling mengsel over een periode van 2 min in 30 s intervallen en blijven roeren voor een extra minuut. Breng de flacon met de emulsie over in een ijscontainer. Ga verder met de volgende bibliotheek vanaf stap 4.7.2. Immers de bibliotheken zijn verwerkt start de incubatie van alle bibliotheken volgens de aanbevelingen van de kit fabrikant. Breng de flacons op de optimale temperatuur voor de ontworpen endonuclease voor een extra 2 uur en zet ze vervolgens op ijs voor ten minste 10 min. 5. Verdere verwerking van bibliotheken en selectie Breng de emulsies van de cryogene flacons over in koude buizen van 1,5 mL, voeg 1 μL van 0,5 M EDTA toe en centrifugeer ze op 13.000 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Verwijder de bovenste oliefase met een pipet. Als een olie-water interfase niet zichtbaar is, de buis gedurende ten minste 5 min in -20 °C uitbroeden om de waterige fase te bevriezen, pijp dan onmiddellijk de vloeibare oliefase uit. Voeg 100 μL van 10 mM Tris HCl pH 8.0 toe en voer onmiddellijk extractie uit met 150 μL fenol:chloroform (1:1 v/v) door korte vortexing gevolgd door fasescheiding door 30 s centrifugatie bij 13.000 x g. Verzamel de bovenste waterige fase. Precipitate het DNA neer door 0,1 vol (15 μL) van 3 M natriumacetaat (pH = 5,2), 2,5-5 μg glycogeen en 2,5 vol (375 μL) ethanol toe te voegen. Incubeer bij -20 °C gedurende 1 uur en centrifugeer gedurende 15 min bij 13.000 x g, 4 °C. Gooi de supernatant weg en was de pellet kort met 1 mL koude 70% ethanol. Droog de DNA/glycogeenpellet in een speedvac of luchtdroog voor >5 min. Los de pellet op in 50 μL van 10 mM Tris-HCl (pH = 7,5). Voeg 5 μL streptavidinmagnetische kralen bereid volgens de instructies van de fabrikant toe en meng gedurende 1 uur bij RT, bij voorkeur in een carrouselmixer of door zachte vortexing. Scheid de kralen op een magnetische standaard en verzamel de vloeistof verrijkt met DNA zonder biotine. Concentraat het DNA door ethanolneerslag (stappen 5.4–5.5). Los het geconcentreerde DNA van de vorige stap op in 5 μL water en gebruik als sjabloon in een PCR-reactie met F2- en R1-primers(tabel 1A).LET OP: Om problemen met sjabloonverontreiniging te voorkomen en PCR-artefacten te minimaliseren, gebruikt u Taq polymerase (niet Pfu of Phusion) en voert u 18-20 cycli uit met de verlengingstijd die evenredig is aan de sjabloongrootte (1 kb = 1 min) (zie tabel 2B). Fractioneer het PCR-product in een agarosegel en knip het verwachte formaatproduct uit. Sommige uitstrijkjes geven aan dat er producten van verschillende grootte zijn (zie figuur 6). Zuiver het DNA van de gelplaat met een commerciële kit. Voer een tweede PCR-reactie uit met maximaal 50 ng DNA van stap 5.10 en primers F1 en R2 met hetzelfde protocol als in stap 5.9. Ga verder met productzuivering zoals beschreven in 5.10. Gezuiverd DNA na kwantificering door agarose gel densitometry (niet UV-spectroscopie) kan worden gebruikt in de volgende ronde van in vitro selectie (stap 4.6). 6. Schermvarianten voor gewijzigde reeksspecificiteit Geselecteerde varianten klonen. Vergiet het product vanaf stap 5.10 tot 2 uur met 10 U van beperkingsenzymen die geschikt zijn voor het klonen van de ORF in de expressievector (voor NlaIV: NcoI en XhoI) in de door de enzymverkoper aanbevolen temperatuur en buffer. Los de producten op met agarosegelelektroforese en isoleer het verwachte groottefragment. Bereid de plasmidevector (bijvoorbeeld pET28) voor door een dubbel decolleté met dezelfde enzymen als in stap 6.1.1 en gel zuiverhet product met een commerciële DNA-gelzuiveringskit. Schat de concentraties vector en insert door densitometry met agarose gel elektroforese. Stel een ligatie in met 1-5 U van T4 DNA ligase en vector:insert molaire ratio 1:3–1:5 in 1x ligase buffer aanbevolen door de enzymleverancier. Incubeer gedurende 2 uur bij RT en introduceer in geschikte gastheerbacteriën (vanaf stap 1.3) door transformatie of elektroporatie12. Selecteer extransforman ten op LB-platen die het juiste antibioticum (50 μg/mL kanamycine voor pET28- of pET30-vectoren) en 1% glucose bevatten. Express eiwitvarianten. Inenting enkele kolonies van de transformatie (tot 24 klonen kunnen gemakkelijk worden verwerkt in een enkele run) in 2 mL lb met kanamycine (50 μg/mL) en 1% glucose en groeien ‘s nachts bij 37 °C met schudden. Inent 15 mL van warm (37 °C) LB met 100 μg kanamycine en geen glucose met 0,75 mL van de nachtcultuur en incubeer bij 37 °C met krachtig schudden.LET OP: Er kunnen centrifugebuizen van 50 mL of 100 mL Erlenmayer kolven worden gebruikt. Voeg 176 μL glycerol toe aan 1 mL nachtcultuur (eindconcentratie van glycerol = 15%) meng grondig en vries bij -70 °C. Na 2-3 uur supplement 15 mL van de cultuur (van stap 6.2.1) met IPTG tot 1 mM en cultuur voor een extra 5 uur. Verzamel de bacteriële pellet door centrifugering (10.000 x g, 4 °C, 10 min) en vries in bij -70 °C. Zuiver de eiwitvarianten. Breng 20 μL nikkelaffiniteitsharssuspensie over in 200 μL B1-buffer in een buis van 1,5 mL met een brede boorpipetpunt, meng voorzichtig en centrifugeer (5.000 x g, 30 s, 4 °C). Verwijder de supernatant door pipetteren en laat de buis op ijs. Stouw de bacteriële pellet van stap 6.2.5 in 300 μL b1 door krachtige vortexing. Breng de schorsing over in een buis van 1,5 mL. Voeg 3 μL van 100x proteaseremmercocktail en lysosoomoplossing toe in B1 (eindconcentratie van 1 mg/mL). Desintegreer de cellen door sonicatie met een tip uitgeruste sonde. Gebruik zes 10 s uitbarstingen per monster met >15 s tip koeling tijd in ijs tussen. Houd de celsuspensingen de hele tijd op ijs. Pelletcelpuin door centrifugering (2 min, 12.000 x g, 4 °C) en breng 250 μL supernatant over naar de harsaliquot vanaf stap 6.3.1. Meng gedurende 15 min in een koude ruimte, bij voorkeur in een carrouselmixer of door zachte vortexing. Centrifugeer (5.000 x g, 30 s, 4 °C) en zuig de supernatant aan met een pipet. Voeg 500 μL W buffer toe en hang de hars voorzichtig op. Centrifugeer (5.000 x g, 30 s, 4 °C) en zuig de supernatant aan met een pipet. Herhaal stap 6.3.7. Voeg 20 μL buffer E toe, stouw de hars voorzichtig op en laat het monster 2-5 min op ijs staan. Centrifugeer (5.000 x g, 30 s, 4 °C) en verzamel de supernatant. Herhaal stap 6.3.9. Zwembad supernatants. Analyseer eiwitmonsters via SDS-PAGE (5-10 μL) (Figuur 7). Scherm voor varianten met de gewijzigde specificiteit. Assay decolleté activiteit op bacteriofaag lambda DNA. Het eiwitmonster kan tot 10% van het uiteindelijke reactievolume uitmaken. Een totaal van 2 μL eiwitmonster per 0,5 μg DNA en 2 uur reactietijd is een goed uitgangspunt. Analyseer de reactieproducten door agarose gel elektroforese samen met de producten gegenereerd door het wilde type enzym. Selecteer de klonen die decolletépatronen genereren die duidelijk te onderscheiden zijn van het patroon dat door het wilde typeenzym wordt gegenereerd voor verdere analyse (figuur 8).