في المختبر إخراج تطور Endonuclease تقييد مع خصوصية أكثر صرامة
Summary
يمكن تطوير الإندونوكليس التقييد مع خصوصية تسلسل جديدة من الإنزيمات التي تعترف بتسلسل منحط جزئيًا. هنا نقدم بروتوكول مفصل استخدمناه بنجاح لتغيير خصوصية تسلسل إنزيم NlaIV. المكونات الرئيسية للبروتوكول هي تجزئة المختبر من رد فعل النسخ / الترجمة واختيار المتغيرات مع خصائص تسلسل جديدة.
Abstract
تقييد endonuclease (REase) هندسة التحديد من الصعب للغاية. هنا نحن وصف بروتوكول متعدد الخطوات التي تساعد على إنتاج المتغيرات REase التي لها خصوصية أكثر صرامة من الإنزيم الأبوي. يتطلب البروتوكول إنشاء مكتبة لأشرطة اختيار التعبير (ESCs) للمتغيرات من REase ، من الناحية المثالية مع تباين في المواقف التي من المرجح أن تؤثر على ربط الحمض النووي. ويحيط ESC على جانب واحد من قبل تسلسل لنشاط موقع تقييد المطلوب وعلامة البيوتين وعلى الجانب الآخر من قبل موقع تقييد للنشاط غير المرغوب فيه وموقع تدليل الصلب. يتم نسخ اللجان الاقتصادية والاجتماعية وترجمتها في مستحلب الماء في الزيت، في الظروف التي تجعل وجود أكثر من جزيء الحمض النووي واحد لكل قطرة من غير المرجح. لذلك ، يخضع الحمض النووي في كل جزيء كاسيت فقط لنشاط الإنزيم المترجم والمشفر. REase المتغيرات من خصوصية المطلوب إزالة العلامة البيوتين ولكن ليس موقع الصلب التمهيدي. بعد كسر مستحلب، تخضع جزيئات الحمض النووي إلى سحب البيوتين، ويتم الاحتفاظ فقط تلك الموجودة في supernatant. تضمن هذه الخطوة الاحتفاظ فقط بـ ESCs للمتغيرات التي لم تفقد النشاط المطلوب. ثم تخضع جزيئات الحمض النووي هذه لتفاعل أول PCR. الانقسام في تسلسل غير مرغوب فيه يقطع موقع الربط التمهيدي لأحد التمهيديات. ولذلك، PCR تضخيم ESCs فقط من قطرات دون النشاط غير المرغوب فيه. ثم يتم إجراء رد فعل ثاني PCR لإعادة إدخال موقع التقييد للخصوصية المطلوبة وعلامة الكائنات الحية ، بحيث يمكن تكرار خطوة الاختيار. يمكن التعبير عن إطارات القراءة المفتوحة المختارة بشكل مفرط في الخلايا البكتيرية التي تعبر أيضًا عن ميثيل ترانسفيلاز cognate من REase الأبوية ، لأن REase المتطورة حديثًا لا تستهدف سوى مجموعة فرعية من المواقع المستهدفة لميثيل ترانسلاز.
Introduction
تسلسل هندسة خصوصية تحديا للغاية للفئة الثانية REases. في هذه الفئة من endonucleases ، يتم الربط بشكل وثيق الاعتراف بالتسلسل والحفز ، على الأرجح كضمان تطوري ضد إنشاء endonuclease من خصوصية أوسع من ميثيل ترانسهاز cognate ، والتي من شأنها أن تلحق الضرر الحمض النووي المضيف. التطور الموجه للخصائص الجديدة في الخلايا يزداد تعقيدًا بسبب الحاجة إلى حماية الحمض النووي المضيف من نشاط endonuclease المهندس حديثًا. لذلك ، لا يوجد سوى عدد قليل من المحاولات الناجحة للهندسة REase المبلغ عنها وكلها تستغل الميزات الفريدة لإنزيم معين1،2،3،4،5،6،7.
هنا نقدم بروتوكول مفصل لهندسة التحديد التي يمكن استخدامها لتوليد المتغيرات endonuclease التي لها خصوصية أضيق من إنزيم الوالدين الذي يقوم على الهندسة الناجحة لدينا من endonuclease NlaIV8. لأي إنزيم من هذا القبيل مع تسلسل الاعتراف التعسفي، يمكن إدخال خصوصية إضافية للقواعد في الجناحين. بالنسبة للإنزيمات الأبوية التي تتعرف على التسلسلات المنحطة جزئيًا (مثل NlaIV مع هدفGGNNCC) ، يمكن أيضًا إدخال خصوصية إضافية ضمن تسلسل الاعتراف. وبما أن التحديد الإضافي من المرجح أن يتطلب اتصالات بين البروتين والحمض النووي، فإن القواعد المعترف بها حديثاً ينبغي أن تقع ضمن بصمة الإندونوسلي الأبوي على الحمض النووي. ومن حيث المبدأ، يمكن وضع مخططات اختيار لأي تخصص مرغوب فيه لتسلسل الاعتراف. ومع ذلك ، فإن معظم REases التي تعترف palindromic وتسلسل الهدف palindromic تقريبا هي dimers الوظيفية التي تعترف فقط نصف موقع palindrome. وبالتالي، فإن اختيار الخصائص الجديدة التي تنتهك التماثل بين التفاعلات النووية البروتينية من غير المرجح أن ينجح. بالنسبة لـ NlaIV الباهت ، على سبيل المثال ، يمكن نظرياً تضييق تسلسل GGNNCC إلى GGATCC ولكن من المتوقع أن يكون تضييق التحديد وصولاً إلى GGAACC أكثر صعوبة. يتضمن مخططنا الاختيار الإيجابي والسلبي على حد سواء.
تكون العملية أكثر كفاءة عندما يتم استخدام التحديد السلبي أيضًا لإزالة الخصائص القادرة على تَصُل كافة التسلسلات بخلاف التحديد الأضيق المفضل. على سبيل المثال، يمكن الجمع بين تحديد GGATCC مع التحديد المضاد ضد GGBVCC (حيث B هو أي قاعدة أخرى غير A، وV هو أي قاعدة أخرى غير T). عندما لا يتم تغطية بعض التسلسلات المستهدفة المحتملة، تعتمد نتيجة تجربة الاختيار على فعالية الاختيار الإيجابي والسلبي. في عملنا NlaIV، اخترنا لGGATCC، وضد GGSSCC (حيث S هو G أو C)، وحصلنا على خصوصية أن، تجاهل التماثل كسر الأهداف، يمكن وصفها بأنها GGWWCC (حيث W هو A أو T)، مما يشير إلى أنه في هذه الحالة بالذات، كان الاختيار السلبي أكثر مهم من الاختيار الإيجابي.
نهجنا يبدأ مع إنشاء كاسيت اختيار التعبير (ESC). واللجنة في إطار أقسام. في القسم الأساسي الداخلي ، هناك متغيرات من إطار القراءة المفتوح (ORF) من REase ، تحت سيطرة T7 المروج. لا يمكن أن يحتوي هذا القسم الأساسي من ESC على أي موقع cognate لـ REase المهندسة. يقع النواة بين موقعين cognate لنوع البرية REase: موقع انشقاق للنشاط غير المرغوب فيه (تسلسل محدد مضاد ، GGSSCC في هذا المثال) وموقع انشقاق للنشاط المطلوب (تسلسل محدد ، GGATCC في المثال). الخطوة الأخيرة من إعداد ESC في PCR يضيف البيوتين قريبة من النشاط المطلوب في نهاية 5 ‘ ويخلق مجموعة متنوعة من تسلسل اتّصال مضادة (GGSSCC في المثال). تعتمد استراتيجية الاختيار على استخدام التصاميم المصممة بعناية في بروتوكول إعادة التضخيم ESC بعد بروتوكول النسخ /الترجمة/الاختيار في المختبر(الشكل 1A). يتم التعبير عن مكتبة ESC في نسخة مجزأة في المختبر مستحلب المياه في الزيت9،10،11. داخل كل قطرة، خصوصية الإنزيم أعرب يؤثر على حالة ESC(الشكل 1B،الخطوة الأولى). بالنسبة للترتيب الموصوف ، يزيل نشاط الانقسام المطلوب للبروتين المترجم علامة البيوتين في الحمض النووي ولكنه لا يؤثر على نهاية ESC الأخرى مع التسلسل المحدد العداد. عندما يتم كسر مستحلب، تتم إزالة شظايا الحيوية tinylated بواسطة السحب تقارب العقدية، بحيث أجزاء فقط من قطرات مع النشاط المطلوب تبقى(الشكل 1B،الخطوة الثانية). هذه الخطوة يزيل المتغيرات REase غير نشط. ثم يتم تضخيم الجزء الفائق من الخطوة المنسدلة بواسطة PCR. في أول التمهيديات تفاعل PCR F2 و R1 يتم استخدامها(الشكل 1A، B،الخطوة الثالثة). يرتبط التمهيدي F2 بقسم ESC بين التسلسل المحدد العداد ونهاية الجزيء. لذلك، لا يتم تضخيم ESCs التعبير عن المتغيرات التي هي قادرة على cleaving تسلسل العداد المحدد (وبالتالي، فصل المواقع ملزمة لالتمهيديF2 و R1 إلى اثنين من جزيئات الحمض النووي المختلفة) وبالتالي يتم إزالتها من المكتبة. يربط التمهيدي R1 بين الموقع المحدد وجوهر ESC بحيث لا يتأثر بحالة الانقسام للموقع المحدد ويستعيد موقع الانقسام للنشاط المطلوب (GGATCC). يتم إغلاق الدورة بواسطة PCR الثاني (مع التمهيديين F1 و R2) الذي يضيف البيوتين في نهاية 5 ‘بالقرب من الموقع المحدد ويستعيد الاختلاف المصمم في الموقع المحدد العداد بالقرب من الطرف الآخر من ESC(الشكل 1B، الخطوة الرابعة). خليط الحمض النووي الناتج جاهز لجولة أخرى من الاختيار.
يعتمد نجاح بروتوكول الاختيار بشدة على الاختيار الصحيح لتسلسل التعرف على الهدف الجديد الأكثر صرامة وعلى التصميم الدقيق لاستراتيجية الطفرات وتنفيذها الفعال. لأنه من الأسهل بكثير لتحسين على تفضيلات طفيفة موجودة مسبقا من REase من التغلب عليها، نوصي بدءا من دراسة حركية من أي تفضيلات موجودة مسبقا. وينتج عن ضرورة تصميم الطفرات الدقيقة الحجم المحدود لمكتبة متحولة يمكن معالجتها من خلال البروتوكول المقدم (109 مستنسخات في تجربة واحدة). لذلك يمكن اختبار جميع بدائل الأحماض الأمينية الممكنة 20 بشكل فعال في مواقف قليلة فقط (انظر المناقشة). وسيؤدي الطفرات العشوائية، مثل الـ PCR المعرضللخطأ (EP-PCR) المقدمة كطريقة بديلة، إلى اختزال عميق في التعقيد القائم. إذا كانت أي معلومات تتعلق بمواقع الأحماض الأمينية المحتملة المشاركة في الاتصالات مع الحمض النووي (أو حتى تقع على مقربة من النيوكليوتيدات المنحطة في تسلسل cognate) متاحة ، فمن المؤكد أنه ينبغي استخدامها لتحديد بعض الأحماض الأمينية لتولد التشبع التشبع الموجه أوليغونوكليوتيد (خطوات البروتوكول 1.6-3.10).
Protocol
Representative Results
Discussion
تم اختبار بروتوكول الاختيار الموصوف هنا لNlaIV8، وهو تسلسل التعرف على أضعاف PD-(D/E) XK خافت يتعرف على موقع هدف palindromic مع قواعد NN المركزية ويحفز قطع نهاية حادة بين قواعد NN. تم اختيار NlaIV لأن الانقسام بين قواعد NN يشير إلى أن هذه القواعد قريبة من البروتين في المجمع. ومن حيث المبدأ، يمكن استخدام البروتوكول لأي تسلسل محدد للنهاية أو المونوميريك أو ديميريك، لأي مجموعة أضعاف، مما يحفز فواصل خصلة مزدوجة من أي متداخل، بغض النظر عما إذا كانت المجالات الحفازة والمحددة تتزامن (كما هو الحال في المثال NlaIV) أو منفصلة (على سبيل المثال، FokI). وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول من حيث المبدأ مفيد ليس فقط لتوليد خصوصية إنزيم جديدة أكثر ضيقا، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم للقضاء على أنشطة النجوم، أو لإنشاء endonucleases عالية الدقة. ومع ذلك، لم يتم اختبار كل هذا بعد. على وجه الخصوص، قد يكون القضاء المستهدف على نشاط النجوم معقدًا، لأن نفس بقايا الأحماض الأمينية يمكن أن تشارك في ربط القواعد المرغوبة وغير المرغوب فيها. ولا تقتصر الخطوات المختبرية الموصوفة في هذا البروتوكول على اختيار الخصائص الضيقة، بل يمكن استخدامها أيضاً لتحديد الخصائص التي تم تغييرها بطريقة أخرى. ومع ذلك ، هناك مشكلة مع endonucleases المتغيرة: إذا كان طيف الركائز يتضمن أهدافًا جديدة لا مكورة من قبل endonuclease الأبوية ، فلا توجد بشكل عام طريقة جيدة لحماية الخلايا من الآثار الضارة لهذا النشاط. وعلى النقيض من ذلك، إذا تم تضييق خصوصية endonuclease فقط، فإن الأهداف هي مجموعة فرعية من أهداف النوع البري، وبالتالي ينبغي أن تكون الميثيل ترانسفيلاز المتاحة بالفعل وقائية بالكامل.
يختلف بروتوكولنا من عدة جوانب عن العديد من بروتوكولات التطور الموجهة. يتم إنشاء تنوع إطار القراءة المفتوحة مرة واحدة في بداية التجربة ، وليس في كل تكرار. وعلاوة على ذلك، يتم إنشاؤه عن طريق التوليف الانقسام ومزيج، بدلا من EP-PCR. بالنسبة لبدائل NNS من codons ، كما هو مستخدم في هذا العمل ، هناك (4 × 4 × 2)6 ~ 1.07 × 109 مجموعات لستة وظائف. ولذلك، فإن أي متغير معين موجود في المتوسط مرة واحدة في 1.7 fmoles من ESC. ويمكن زيادة هذه القدرة إلى سبعة مواقع باستخدام التوليف مع خليط من 20 سلائف ترينوكليوتيد التي تقدمها غلين للبحوث أو عن طريق خفض تردد الطفرة في مواقف أقل واعدة مع تخليق oligonucleotide الانقسام ومزيج. إذا كان ذلك ممكنا، فمن المستحسن للحد من مدى الاختلاف إلى ستة وظائف. ومن الواضح أن مثل هذا الاستهداف الطفرات يتطلب بعض المعرفة الموجودة مسبقا حول مناطق REase على الأقل المشاركة في ربط الركيزة. ولبروتوكول التقسيم والمزيج لتوليد التنوع مزايا واضحة بالمقارنة مع EP-PCR. باستخدام EP-PCR، حصلنا على متغيرات وتسلسل اتّصال دون تغيير تحمل ثمانية استبدالات لـ NlaIV ESCs في نفس EP-PCR(الجدول 4). تحتوي المكتبة من EP-PCR على جزء كبير من المستنسخين التي يجب تجنبها (تسلسل اتّحادية نوع، استبدالات متعددة، تحول الإطار والطفرات هراء، والطفرات في الأماكن التي من غير المحتمل أن تؤثر على خصوصية التسلسل).
يختلف بروتوكولنا أيضًا عن العديد من بروتوكولات التطور الموجهة الأخرى من خلال وجود خطوتين اختيار متتاليتين. الاختيار الإيجابي يتأكد من الاحتفاظ بالنشاط المطلوب، وإلا لا تتم إزالة علامة biotin، ويمكن إزالة تسلسل الترميز عن طريق السحب. من الممكن من الناحية الفنية أن يؤدي الظهور الصدفة لخصوصية جديدة غير متداخلة (على سبيل المثال GCATGC) إلى قطع علامة البيوتين أيضًا ، إذا كان موقع الانقسام المناسب موجودًا بالقرب من الانقسام المطلوب ، ولكن ليس في أي مكان آخر. ومع ذلك، ينبغي أن يكون هذا مستبعداً إلى حد كبير. يزيل التحديد السلبي إطارات القراءة المفتوحة التي تعمل على ترميز الإنزيمات التي لا يزال النشاط غير المرغوب فيها. هذه الخطوة ليست إلزامية تماماً، لأن البروتوكول سوف لا يزال إثراء مكتبة الإخراج مع المتغيرات التي هي قادرة على التجانب تسلسل التحديد ولكن غير قادر على التداعي في مكان آخر في ESC، وبالتالي جعلها غير مناسبة لتضخيم PCR. ومع ذلك، من المتوقع أن تكون فعالية الاختيار أقل لأن الإنزيمات ذات خصوصية التسلسل الأصلي لن تتم إزالتها من الإخراج وسوف تتفوق على المتغيرات الواعدة مع تغيير التحديد ولكن أيضًا انخفاض النشاط الأنزيمي. لاحظ أنه على مستوى السكان، يمكن لكل من تسلسل الأهداف المرغوب ة وغير المرغوب فيها، ولكن ليس من الضروري أن تكون، أن تتدهور. وفي المثال NlaIV، كان الهدف المضاد للهدف منحطاً والهدف غير منحط. وحتى عندما يكون هناك انحطاط على مستوى السكان، لا يوجد في قطرة واحدة سوى هدف واحد (غير منحط) أو هدف مضاد. في بروتوكولنا، يتم إعادة إدخال التسلسلات المستهدفة والمضادة للأهداف عند كل تكرار لخطوات الاختيار. لذلك ، يجب أن يقوم إطار القراءة المفتوح بترميز إنزيم قادر على التداعي لجميع الأهداف المحتملة ، وغير قادر على التشعب بأي من الأهداف المضادة ، للبقاء على قيد الحياة في جولات الاختيار المتعددة. لاحظ أن الحاجة إلى إعادة إدخال هدف التحديد المضاد في كل تكرار للبروتوكول يفرض اثنين من PCRs متسلسلة. يستخدم PCR الأول التمهيدي الذي يناز خارج المضادة للهدف، بحيث الانقسام من المضادة للهدف يمنع تفاعل PCR. يتطلب PCR الثاني التمهيدي الذي يتجاوز المضادة للهدف، ويعيد إدخال المضادة للهدف، للتأكد من أنه خلال جولات متعددة من الاختيار، يتم اختبار كل إطار قراءة مفتوحة ضد جميع المتغيرات من المضادة للهدف.
بالنسبة للإنزيمات التي تولد نهايات لزجة ، يمكن استخدام بروتوكول بديل ذي صلة يستند إلى طريقة تم وصفها سابقًا لعزل REase ORF10. يتم استبدال استنفاد المتغيرات غير النشطة بواسطة التقاط البيوتين المستخدم في تجاربنا في البروتوكول البديل بربط المحول المتوافق مع تسلسل يستخدم كموقع ربط التمهيدي في PCR انتقائي(الشكل 9). فقط ESCs التي تنتج الإنزيمات مع التحديد المحدد توليد نهايات قادرة على الربط وبالتالي سيتم اختيارها. يجب تصميم تسلسل النهاية اللاصقة للتسلسل eselected العداد بطريقة لا يمكن المشاركة في الربط مع المحولات. يمكن بسهولة تحقيق تكرار عملية الاختيار عن طريق التبديل بين اثنين من محولات مختلفة وبالتالي اثنين من التمهيديات عكس مختلفة في PCR انتقائية.
حتى مع البروتوكولات الجديدة ، فإن مهمة خصائص الرواية الهندسية في المختبر لا تزال صعبة للغاية. بالنسبة للنوع النموذجي II REases ، تعتمد خصوصية التسلسل والنشاط الأندوكليوليتيك على نفس مناطق البروتين. ولذلك من الصعب تغيير أحدهما دون التأثير على الآخر. يتم تحقيق النجاح على الأرجح من خلال استراتيجية تأخذ في الاعتبار بصمة الإنزيم ، وتحترم التماثل بين تفاعلات البروتين والحمض النووي ، وتبني على التفضيلات الأنزيمية الموجودة مسبقًا ، والتي يجب تحديدها مقدمًا في التجارب الكيميائية الحيوية ، كما تم القيام به للمثال NlaIV8.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل بالمنح المقدمة من وزارة العلوم والتعليم العالي (0295/B/PO1/2008/34 إلى MB وN301 100 31/3043 إلى KS)، من المركز الوطني البولندي للعلوم (UMO-2011/02/A/NZ1/00052، UMO-2014/13/B/NZ1/03991 وUMO-2014/14/M/NZ5/00558 إلى MB) وبزمالة EMBO قصيرة الأجل إلى KS (ATSF 277.00-05).
Materials
| 1000Å CPG Support (dA, dT, dC, dG) | Biosset | 45-1000-050 | Other vendors can be used as well |
| ASM-800 DNA/RNA | Biosset | 800-001-000 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | Any other kit can be used |
| Glen-Pak DNA purification cartridge | Glen Research | 60-5200 | |
| HIS-Select Nickel Affinity Gel | Sigma | P6611 | |
| pET 28a vector | Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead | ||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F530S | Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead |
| Porous steel foil | Biosset | 40-063 | |
| Rapid Translation System RTS 100, E.coli HY Kit |
Roche | 3 186 148 | |
| Restriction endonucleases | Thermo Scientific | Obviously other vendors, enzymes can be used | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma |
| Synthesis chemicals including phosphoramidities | Carl Roth | Other vendors can be used as well | |
| Synthesis columns (different sizes) | Biosset | ||
| T4 DNA ligase | Thermo Scientific | EL0011 | Any other ligase can be used |
References
- Schöttler, S., Wenz, C., Lanio, T., Jeltsch, A., Pingoud, A. Protein engineering of the restriction endonuclease EcoRV–structure-guided design of enzyme variants that recognize the base pairs flanking the recognition site. European Journal of Biochemistry. 258 (1), 184-191 (1998).
- Wenz, C., Hahn, M., Pingoud, A. Engineering of variants of the restriction endonuclease EcoRV that depend in their cleavage activity on the flexibility of sequences flanking the recognition site. Biochemistry. 37 (8), 2234-2242 (1998).
- Samuelson, J. C., Xu, S. Y. Directed evolution of restriction endonuclease BstYI to achieve increased substrate specificity. Journal of Molecular Biology. 319 (3), 673-683 (2002).
- Samuelson, J. C., et al. Engineering a rare-cutting restriction enzyme: genetic screening and selection of NotI variants. Nucleic Acids Research. 34 (3), 796-805 (2006).
- Rimseliene, R., Maneliene, Z., Lubys, A., Janulaitis, A. Engineering of restriction endonucleases: using methylation activity of the bifunctional endonuclease Eco57I to select the mutant with a novel sequence specificity. Journal of Molecular Biology. 327 (2), 383-391 (2003).
- Morgan, R. D., Luyten, Y. A. Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity. Nucleic Acids Research. 37 (15), 5222-5233 (2009).
- Skowronek, K., Boniecki, M. J., Kluge, B., Bujnicki, J. M. Rational engineering of sequence specificity in R.MwoI restriction endonuclease. Nucleic Acids Research. 40 (17), 8579-8592 (2012).
- Czapinska, H., et al. Crystal Structure and Directed Evolution of Specificity of NlaIV Restriction Endonuclease. Journal of Molecular Biology. 431 (11), 2082-2094 (2019).
- Miller, O. J., et al. Directed evolution by in vitro compartmentalization. Nature Methods. 3 (7), 561-570 (2006).
- Zheng, Y., Roberts, R. J. Selection of restriction endonucleases using artificial cells. Nucleic Acids Research. 35 (11), e83 (2007).
- Takeuchi, R., Choi, M., Stoddard, B. L. Redesign of extensive protein-DNA interfaces of meganucleases using iterative cycles of in vitro compartmentalization. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), 4061-4066 (2014).
- Howland, J. L., Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Short Protocols in Molecular Biology. , (1995).
- Wilson, D. S., Keefe, A. D. Chapter 8 Unit 8.3: Random mutagenesis by PCR. Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
