Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem
Summary
Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.
Abstract
Formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) dokularda multispektral floresan görüntüleme, tek bir doku örneğinde antijen koekspresyonu ve belirteçlerin mekansal dağılımı hakkında bilgi sağlayabilen birden fazla belirteç saptanmasını sağlar. Ancak, formalin-sabit dokular için uygun antikoreksikliği tespit edilebilir belirteçlerin doğasını kısıtlayabilir. Buna ek olarak, boyama yöntemi zaman alıcıdır. Burada dondurulmuş dokularda multispektral floresan görüntüleme yapmak için hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem kullanılan florofor kombinasyonları, fare ve insan dondurulmuş dokuların boyama için ayrıntılı adımlar ve tarama, edinim ve analiz prosedürleri içerir. Boyama analizi için, ticari olarak kullanılabilen yarı otomatik multispektral floresan görüntüleme sistemi kullanılır. Bu yöntemle, en fazla altı farklı belirteçler lekeli ve tek bir dondurulmuş doku bölümünde tespit edildi. Makine öğrenme analiz yazılımı kantitatif analiz için kullanılabilecek hücreleri fenotip olabilir. Burada dondurulmuş dokular için açıklanan yöntem FFPE dokularında tespit edilemeyen veya FFPE dokuları için antikor bulunmayan belirteçlerin saptanmasında yararlıdır.
Introduction
Mikroskobik görüntüleme tekniklerindeki son gelişmeler, biyolojik süreçler ve hastalık durumları hakkındaki bilgi mizi ve anlayışımızı önemli ölçüde geliştirmiştir. Kromozomimmünohistokimya (IHC) yoluyla dokularda proteinlerin yerinde tespiti patolojide rutin olarak yapılmaktadır. Ancak, kromojenik IHC boyama kullanarak birden fazla belirteç lerin saptanması1 zorlu ve birden fazla biyolojik belirteçtekbir doku örneğinde etiketlendiği multipleks immünoresans (mIF) boyama yaklaşımları kullanmak için yeni yöntemler geliştirilmektedir. Doku mimarisi, hücrelerin mekansal dağılımı ve antijen ko-ekspresyonu ile ilgili bilgiler tek bir doku örneği2yakalanır, çünkü birden fazla biyolojik belirteçlerin tespiti yararlıdır. Multispektral floresan görüntüleme teknolojisinin kullanımı birden fazla biyolojik belirteç lerin tespitini mümkün kılmıştır. Bu teknolojide, belirli optik kullanarak her bir florofor floresan spektrumları ayrılabilir veya “karışmamış”, herhangi bir spektral crosstalk olmadan birden fazla belirteçlerin algılanmasını sağlayan3. Multispektral floresan görüntüleme hücre biyolojisi, preklinik ilaç gelişimi, klinik patoloji ve tümör immün profilleme4,5,5,6kritik bir yaklaşım haline gelmektedir. Daha da önemlisi, bağışıklık hücrelerinin aralıklı dağılımı (özellikle CD8 T hücreleri) mevcut tümörleri olan hastalar için bir prognostik faktör olarak hizmet verebilir7.
Çokleksi floresan boyama için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir ve aynı anda veya sırayla yapılabilir. Eşzamanlı boyama yönteminde, tüm antikorlar tek bir adımda bir kokteyl olarak doku etiketlemek için bir araya eklenir. UltraPlex teknolojisi hapten konjuge birincil antikorlar bir kokteyl ve florofor konjuge anti-hapten ikincil antikorlar bir kokteyl kullanır. InSituPlex teknolojisi8 aynı anda bir amplifikasyon adım ve son olarak birincil antikor her benzersiz DNA dizisi tamamlayıcı florofor konjuge problar takip doku eklenir benzersiz DNA konjuge birincil antikorlar bir kokteyl kullanır. Bu teknolojilerin her ikisi de nükleer boyama için dört belirteç artı 4′,6-diamino-2-fenilindole (DAPI) tespitisağlar. Eşzamanlı multipleks boyama için diğer iki yaklaşım ikincil iyon kütle spektrometresi dayanmaktadır9. Hyperion Görüntüleme Sistemi 37 belirteçleri tespit etmek için görüntüleme kitle sitometri10 kullanır. Bu teknoloji dokuları lekelemek için metal konjuge antikorlar bir kokteyl kullanır, ve dokuların belirli alanlarda bir lazer tarafından ablated ve metal iyonları tespit edilen bir kitle sitometre aktarılır. Başka bir benzer teknoloji IONPath, hangi multiplexed iyon ışını görüntüleme teknolojisi11kullanır. Bu teknoloji, metal konjuge antikorları ablate lazer yerine değiştirilmiş bir kütle spektrometresi alet ve oksijen iyon kaynağı kullanır. Tüm bu eşzamanlı multipleks boyama yaklaşımları birden fazla belirteçlerin saptanmasını sağlarken, DNA, haptens veya metallerin antikorlara konjugasyonu için yapılan maliyetler, ablasyon nedeniyle doku kaybı ve karıştırmayı ortadan çıkarmak için kapsamlı görüntü işleme hafife alınamaz. Ayrıca, kitleri ve boyama protokolleri şu anda sadece FFPE dokular için kullanılabilir ve özel paneller geliştirmek ek zaman ve harcama gerektirir.
Sıralı multipleks boyama yöntemi, aksine, bir işaretleyici bir antikor ile doku etiketleme içerir, antikor kaldırmak için sıyırma, birden fazla işaretleri etiketlemek için bu sürecin ardışık tekrarları takip12. Tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) en sık kullanılan ardışık çoklama yöntemidir. Diğer iki çoklama teknolojisi, eşzamanlı ve sıralı boyama yöntemlerinin bir kombinasyonunu kullanır. CODEX platformu13, 50’ye kadar belirteç tespit etmek için süreci görüntüleme, sıyırma ve yineleme nin ardından indeksli polimerizasyon adımı kullanılarak florofor ile etiketlenen benzersiz DNA oligonükleotid dizilerine konjuge antikorlardan oluşan bir kokteyl kullanır. MultiOmyx multiplex boyama yaklaşımı14 üç ila dört florofor konjuge antikorlar bir kokteyl ile boyama bir yineleme, görüntüleme, floroforlar söndürme, ve tek bir bölümde 60 belirteçleri kadar tespit etmek için bu döngünüks. Eşzamanlı multipleks boyama yöntemine benzer şekilde, çok çeşitli belirteçler tespit edilebilirken, boyama, görüntü edinme, işleme ve analiz de dahil olmak üzere zaman geniştir. Sıyırma/söndürme adımı, doku örneğinin ısıtılması ve/veya beyazlatma işlemini içerir ve böylece, sıralı multipleks boyama yaklaşımı genellikle ısıtma veya ağartma üzerine doku bütünlüğünü koruyan FFPE dokularda gerçekleştirilir.
Formalin fiksasyonu ve sonraki parafin katıştırma klinik ortamda kolayca yapılır, doku blokları nın saklanması kolaydır ve birkaç multipleks boyama protokolü mevcuttur. Ancak, işleme, katıştırma ve FFPE dokuların deparafinizasyon, yanı sıra antijen alma15, antikorlar daha iyi epitoplar erişebilirsiniz hangi bir süreç, zaman alıcıdır. Ayrıca, FFPE dokularında yer alan işleme otofloresans katkıda16 ve maskeler hedef epitoplar, değişkenlik ve FFPE dokularda antijenleri tespit etmek için mevcut antikor klon eksikliği ile sonuçlanan17,18,19. Bir örnek insan lökosit antijeni (HLA) sınıf I alel20olduğunu. Buna karşılık, dokuların hızlı dondurma önce veya sabitleme sonra kapsamlı işleme adımları içermez, antijen alma ihtiyacını atlatmak21,22, ve hedeflerin daha geniş bir yelpazede tespit etmek için yararlı hale. Bu nedenle, multispektral floresan görüntüleme için dondurulmuş dokuların kullanılması preklinik ve klinik çalışmalar için hedefleri tespit etmek için değerli olabilir.
FFPE dokuları kullanırken yukarıda belirtilen sınırlamalar göz önüne alındığında, dondurulmuş dokularda multispektral floresan görüntüleme yapılıp yapılamayacağını sorduk. Bu soruyu çözmek için, birden fazla antijeni tespit etmek için florofor konjuge antikorlardan oluşan bir panel kullanarak eşzamanlı çok katlı boyama yöntemini test ettik ve yarı otomatik multispektral görüntüleme sistemi kullanarak boyama analiz ettik. Aynı anda 90 dakika içinde tek bir doku bölümünde altı belirteçleri kadar leke başardık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dondurulmuş dokular yaygın geleneksel doğrudan ve dolaylı yöntem32kullanarak bir doku üzerinde üç ila dört belirteçleri31 tespit etmek için mIF görüntüleme için kullanılmıştır. Doğrudan yöntemde, antikorlar floresan boyalar veya kuantum nokta33 doku etiketlemek için konjuge edilir, dolaylı yöntemde ise, konjuge olmayan bir birincil antikor özellikle birincil antikor tanıyan bir florofor-konjuge ikincil antikor takip doku eti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Görüntüleme ve analiz rehberliği, Chicago’daki Illinois Üniversitesi’nde Araştırma Kaynakları Merkezi – Araştırma Histolojisi ve Doku Görüntüleme Çekirdeği tarafından, Araştırma dan sorumlu Rektör Yardımcısı’nın desteğiyle kurulmuştur. Çalışma NIH / NCI RO1CA191317 clp, NIH / NIAMS (SBDRC hibe 1P30AR075049-01) Dr A. Paller ve Robert H. Lurie Kapsamlı Kanser Merkezi desteği ile Northwestern Üniversitesi’nde İmmünoterapi Değerlendirme Çekirdek desteklendi.
Materials
| Acetone (histological grade) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixing tissues |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | BioLegend | 100212 | Clone – 17A2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone – L26; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-human CD3 | BioLegend | 300446 | Clone – UCHT1; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100758 | Clone – 53-6.7; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-human CD8a | BioLegend | 372906 | Clone – C8/144B; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone – C068C2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100426 | Clone – GK1.5; primary conjugated antibody |
| C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Mouse frozen tissues used for multispectral training |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Rehydrating and washing slides |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | Nucleic Acid stain |
| Diamond White Glass Charged Slides | DOT Scientific | DW7590W | Adhering tissue sections |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Washing and diluent |
| Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protecting stained tissues |
| Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block | AMSBio | AMS6023 | Human frozen tissue used for multispectral staining |
| Human Serum 1X | Gemini Bio-Products | 100-512 | Blocking and diluent for human tissues |
| inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | Machine learning software |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | BioLegend | 300529 | Clone – RPA-T4; primary conjugated antibody |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone – M1/70; primary conjugated antibody |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | Whole slide scan software |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | Sectioning tissues |
| Superblock 1X | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocking mouse tissues |
| Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Embedding tissues |
| Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Semi-automated multispectral imaging system |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | Software to operate microscope |
References
- van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
- Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Wickenhauser, C., Pico de Coaña, Y., et al. . Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. , 13-31 (2019).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47 (2015).
- Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
- Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
- Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
- Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
- Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
- Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
- Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
- Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
- Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
- Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
- Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
- Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479 (1999).
- Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017 (2014).
- van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
- Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
- Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
- Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
- Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
- Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
- Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
- Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
- de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03 (2019).
- Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
- Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
- Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
- Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652 (2017).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
- Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
- Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338 (2019).
