Un método rápido para imágenes de fluorescencia multiespectral de secciones de tejido congelado

Los avances recientes en las técnicas de imágenes microscópicas han mejorado significativamente nuestro conocimiento y comprensión de los procesos biológicos y los estados de las enfermedades. La detección in situ de proteínas en los tejidos a través de la inmunohistoquímica cromogénica (IHC) se realiza rutinariamente en patología. Sin embargo, la detección de múltiples marcadores mediante la tinción cromogénica de IHC es un desafío¹ y se están desarrollando métodos más recientes para utilizar enfoques de tinción de inmunofluorescencia múltiple (mIF), en los que se están desarrollando múltiples marcadores biológicos etiquetados en una sola muestra de tejido. La detección de múltiples marcadores biológicos es útil, ya que la información relacionada con la arquitectura tisular, la distribución espacial de las células y la coexpresión de antígenos se capturan en una sola muestra de tejido^2. El uso de la tecnología de imágenes multiespectrales de fluorescencia ha hecho posible la detección de múltiples marcadores biológicos. En esta tecnología, utilizando ópticas específicas, los espectros de fluorescencia de cada fluoróforo individual pueden separarse o “sin mezclar”, permitiendo la detección de múltiples marcadores sin ninguna conversación cruzada espectral^3. La fluorescencia multiespectral se está convirtiendo en un enfoque crítico en biología celular, desarrollo de fármacos preclínicos, patología clínica y perfilinmune tumoral^4,,5,6. Es importante destacar que la distribución espacial de las células inmunitarias (específicamente células T CD8) puede servir como factor pronóstico para los pacientes con tumores existentes⁷.

Se han desarrollado varios enfoques para la tinción de fluorescencia multiplex y se pueden realizar simultáneamente o secuencialmente. En el método de tinción simultánea, todos los anticuerpos se suman como un cóctel en un solo paso para etiquetar el tejido. La tecnología UltraPlex utiliza un cóctel de anticuerpos primarios conjugados con ya hapten seguido de un cóctel de anticuerpos secundarios anti-hapten conjugados con fluoróforos. La tecnología InSituPlex⁸ utiliza un cóctel de anticuerpos primarios únicos conjugados por EL ADN que se añaden simultáneamente al tejido seguido de un paso de amplificación y finalmente sondas conjugadas con fluoróforoque que son complementarias a cada secuencia de ADN única en el anticuerpo primario. Ambas tecnologías permiten la detección de cuatro marcadores más 4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) para la tinción nuclear. Otros dos enfoques para la tinción multiplexación simultánea se basan en espectrometría de masas iónquinas^{secundarias 9.} El sistema de imágenes Hyperion utiliza citometría de masa de imágenes¹⁰ para detectar hasta 37 marcadores. Esta tecnología utiliza un cóctel de anticuerpos conjugados metálicos para manchar los tejidos, y áreas específicas de los tejidos son abladas por un láser y transferidas a un citómetro de masa donde se detectan los iones metálicos. Otra tecnología similar es la IONPath, que utiliza la tecnología de imágenes de haz iónico multiplexado¹¹. Esta tecnología utiliza un instrumento de espectrometría de masas modificado y una fuente de iones de oxígeno en lugar de láser para ablar los anticuerpos conjugados de metal. Si bien todos estos enfoques simultáneos de tinción múltiple permiten la detección de múltiples marcadores, no se pueden subestimar los costos involucrados por la conjugación de ADN, hapens o metales a anticuerpos, la pérdida de tejido debido a la ablación y el procesamiento de imágenes extenso para la desmezcla. Además, los kits y los protocolos de tinción están actualmente disponibles sólo para los tejidos FFPE y el desarrollo de paneles personalizados implica tiempo y gastos adicionales.

El método de tinción múltiple secuencial, en cambio, incluye etiquetar el tejido con un anticuerpo en un marcador, desmontar para eliminar el anticuerpo, seguido de repeticiones secuenciales de este proceso para etiquetar múltiples marcadores^12. La amplificación de señal de tiramida (TSA) es el método de multiplexación secuencial más utilizado. Otras dos tecnologías de multiplexación utilizan una combinación de métodos de tinción simultáneos y secuenciales. La plataforma^{CODEX 13} emplea un cóctel de anticuerpos conjugados con secuencias únicas de oligonucleótidos de ADN que finalmente se etiquetan con un fluoróforo utilizando un paso de polimerización indexado seguido de imágenes, desmontaje y repetición del proceso para detectar hasta 50 marcadores. El enfoque de tinción múltiple MultiOmyx¹⁴ es una iteración de tinción con un cóctel de tres a cuatro anticuerpos conjugados con fluoróforos, imágenes, temple los fluoróforos y repetición de este ciclo para detectar hasta 60 marcadores en una sola sección. Al igual que el método de tinción múltiple simultánea, mientras que se puede detectar una amplia gama de marcadores, el tiempo involucrado en la tinción, la adquisición de imágenes, el procesamiento y el análisis es extenso. El paso de desmontaje/enfriamiento implica calentar y/o blanquear la muestra de tejido y, por lo tanto, el enfoque secuencial de tinción multiplex a los tejidos FFPE que mantienen la integridad del tejido al calentarse o blanquear.

La fijación de formalina y la posterior incrustación de parafina se realiza fácilmente en un entorno clínico, los bloques de tejido son fáciles de almacenar y varios protocolos de tinción multiplex están disponibles. Sin embargo, el procesamiento, incrustación y desparafinación de los tejidos FFPE, así como la recuperación de antígeno¹⁵, un proceso por el cual los anticuerpos pueden acceder mejor a los epítopos, es lento. Además, el procesamiento implicado en los tejidos FFPE contribuye a la autofluorescencia¹⁶ y enmascara los epítopos diana, lo que resulta en la variabilidad y falta de clon de anticuerpos disponible para detectar antígenos en los tejidos FFPE^17,,18,,19. Un ejemplo es el antígeno leucocito humano (HLA) clase I alelos²⁰. Por el contrario, la congelación rápida de los tejidos no implica extensos pasos de procesamiento antes o después de la fijación, eludiendo la necesidad de recuperación de antígenos^21,22, y lo que es beneficioso para detectar una gama más amplia de objetivos. Por lo tanto, el uso de tejidos congelados para la fluorescencia multiespectral puede ser valioso para detectar dianas para estudios preclínicos y clínicos.

Dadas las limitaciones mencionadas anteriormente al usar tejidos FFPE, preguntamos si se pueden realizar imágenes de fluorescencia multiespectral en tejidos congelados. Para abordar esta pregunta, probamos un método de tinción múltiple simultánea utilizando un panel de anticuerpos conjugados con fluoróforos para detectar múltiples antígenos y analizamos la tinción utilizando un sistema de imágenes multiespectrales semiautomáticos. Pudimos manchar simultáneamente hasta seis marcadores en una sola sección de tejido en un solo radio de 90 minutos.