Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado

Os recentes avanços em técnicas de imagem microscópica melhoraram significativamente nosso conhecimento e compreensão dos processos biológicos e estados de doenças. In situ detecção de proteínas em tecidos via imunohistoquímica cromogênica (IHC) é realizada rotineiramente na patologia. No entanto, a detecção de múltiplos marcadores usando a coloração cromogênica do IHC está desafiando¹ e métodos mais novos para usar abordagens de coloração multiplex imunofluorescência (mIF), onde vários marcadores biológicos são rotulados em uma única amostra de tecido, estão sendo desenvolvidos. A detecção de múltiplos marcadores biológicos é útil, pois as informações relacionadas à arquitetura tecidual, distribuição espacial das células e co-expressão de antígenos são capturadas em uma única amostra de tecido². O uso da tecnologia de imagem de fluorescência multiespectral tornou possível a detecção de múltiplos marcadores biológicos. Nesta tecnologia, utilizando óptica específica, o espectro de fluorescência de cada fluoróforo individual pode ser separado ou “não misturado”, permitindo a detecção de múltiplos marcadores sem qualquer crosstalk espectral³. A imagem de fluorescência multiespectral está se tornando uma abordagem crítica na biologia celular, desenvolvimento de fármacos pré-clínicos, patologia clínica e perfil imunológico do tumor^4,5,6. É importante ressaltar que a distribuição espaçada das células imunes (especificamente as células CD8 T) pode servir como fator prognóstico para pacientes com tumores existentes⁷.

Várias abordagens para a coloração de fluorescência multiplex foram desenvolvidas e podem ser realizadas simultaneamente ou sequencialmente. No método de coloração simultânea, todos os anticorpos são adicionados como um coquetel em um único passo para rotular o tecido. A tecnologia UltraPlex usa um coquetel de anticorpos primários conjugados com hapten seguido de um coquetel de anticorpos secundários anti-hapten conjugados com fluoroforre. A tecnologia InSituPlex⁸ usa um coquetel de anticorpos primários conjugados com DNA únicos que são simultaneamente adicionados ao tecido seguido de um passo de amplificação e finalmente sondas conjugadas com fluoroforre que são complementares a cada seqüência de DNA única no anticorpo primário. Ambas as tecnologias permitem a detecção de quatro marcadores mais 4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) para coloração nuclear. Duas outras abordagens para coloração multiplex simultânea são baseadas na espectrometria de massa de íons secundária⁹. O Sistema de Imagem Hyperion usa citometria de massa de imagem¹⁰ para detectar até 37 marcadores. Esta tecnologia usa um coquetel de anticorpos conjugados em metal para manchar os tecidos, e áreas específicas dos tecidos são ablatadas por um laser e transferidas para um citómetro de massa onde os íons metálicos são detectados. Outra tecnologia semelhante é o IONPath, que usa tecnologia de imagem de feixe de íons multiplexados¹¹. Esta tecnologia usa um instrumento de espectrometria de massa modificado e uma fonte de íons de oxigênio em vez de laser para abpartir os anticorpos conjugados com metal. Embora todas essas abordagens simultâneas de coloração multiplex permitam a detecção de múltiplos marcadores, os custos envolvidos para conjugar DNA, haptens ou metais a anticorpos, a perda de tecido devido à ablação e o processamento extensivo de imagem para desmisturanão não podem ser subestimados. Além disso, kits e protocolos de coloração estão atualmente disponíveis apenas para tecidos FFPE e o desenvolvimento de painéis personalizados implica tempo e gastos adicionais.

O método sequencial de coloração multiplex, em contraste, inclui rotular o tecido com um anticorpo para um marcador, descascando para remover o anticorpo, seguido por repetições seqüenciais deste processo para rotular múltiplos marcadores¹². A amplificação do sinal de tyramide (TSA) é o método de multiplexação seqüencial mais utilizado. Duas outras tecnologias de multiplexação usam uma combinação de métodos de coloração simultâneas e seqüenciais. A plataforma CODEX¹³ emprega um coquetel de anticorpos conjugados a sequências únicas de DNA oligonucleotídeo que são eventualmente rotulados com um fluoróforo usando uma etapa de polimerização indexada seguida de imagem, descascamento e repetição do processo para detectar até 50 marcadores. A abordagem de coloração multiplex MultiOmyx¹⁴ é uma iteração de coloração com um coquetel de três a quatro anticorpos conjugados com fluoroformes, imagem, saciação dos fluoróforos, e repetindo este ciclo para detectar até 60 marcadores em uma única seção. Semelhante ao método de coloração multiplex simultâneo, enquanto uma ampla gama de marcadores pode ser detectada, o tempo envolvido na coloração, aquisição de imagens, processamento e análise é extenso. A etapa de descascamento/saciedade envolve aquecimento e/ou branqueamento da amostra de tecido e, portanto, a abordagem sequencial de coloração multiplex é comumente realizada em tecidos FFPE que mantêm a integridade do tecido ao aquecer ou branquear.

A fixação da formalina e a incorporação subseqüente de parafina são prontamente realizadas em um ambiente clínico, blocos de tecido são fáceis de armazenar e vários protocolos de coloração multiplex estão disponíveis. No entanto, o processamento, incorporação e deparafinação dos tecidos de FFPE, bem como a recuperação de antígenos¹⁵, um processo pelo qual os anticorpos podem acessar melhor os epítopos, é demorado. Além disso, o processamento envolvido nos tecidos ffpe contribui para a autofluorescência¹⁶ e mascara epitopes-alvo, resultando na variabilidade e falta de clone de anticorpos disponíveis para detectar antígenos nos tecidos FFPE^17,18,19. Um exemplo é o antígeno leucócito humano (HLA) classe I alelos²⁰. Em contraste, o congelamento instantâneo de tecidos não envolve etapas de processamento extensivas antes ou depois da fixação, contornando a necessidade de recuperação de antígenos^21,22, e tornando-o benéfico para a detecção de uma gama mais ampla de alvos. Portanto, o uso de tecidos congelados para imagens de fluorescência multiespectrais pode ser valioso para detectar alvos para estudos pré-clínicos e clínicos.

Dadas as limitações acima mencionadas ao usar tecidos FFPE, perguntamos se a imagem de fluorescência multiespectral pode ser realizada em tecidos congelados. Para responder a essa questão, testamos um método de coloração multiplex simultâneo usando um painel de anticorpos conjugados com fluoroforo para detectar múltiplos antígenos e analisamos a coloração usando um sistema de imagem multiespectral semi-automatizado. Conseguimos simultaneamente manchar até seis marcadores em uma única seção de tecido dentro de 90 minutos.