Un metodo rapido per l'imaging della fluorescenza multispettrale delle sezioni dei tessuti congelati

I recenti progressi nelle tecniche di imaging microscopico hanno migliorato significativamente le nostre conoscenze e la comprensione dei processi biologici e degli stati della malattia. Il rilevamento in situ delle proteine nei tessuti tramite immunohistochimica cromogenica (IHC) viene regolarmente eseguito in patologia. Tuttavia, il rilevamento di più marcatori che utilizzano la colorazione IHC cromogenica è difficile¹ e metodi più recenti per utilizzare approcci di colorazione multifluorescenza (mIF), in cui più marcatori biologici sono etichettati su un singolo campione di tessuto, sono in fase di sviluppo. La rilevazione di più marcatori biologici è utile, perché le informazioni relative all’architettura dei tessuti, alla distribuzione spaziale delle cellule e alla co-espressione dell’antigene sono tutte catturate in un campione di tessuto singolo². L’uso della tecnologia di imaging a fluorescenza multispettrale ha reso possibile il rilevamento di più marcatori biologici. In questa tecnologia, utilizzando ottiche specifiche, gli spettri di fluorescenza di ogni singolo fluoroforo possono essere separati o “non miscelati”, consentendo il rilevamento di più marcatori senza alcun crosstalk spettrale³. L’imaging a fluorescenza multispettrale sta diventando un approccio critico nella biologia cellulare, nello sviluppo di farmaci preclinici, nella patologia clinica e nella profilazione immunitaria del tumore^4,5,6. È importante sottolineare che la distribuzione di cellule immunitarie (in particolare le cellule T CD8) può servire come fattore prognostico per i pazienti con tumori esistenti⁷.

Sono stati sviluppati vari approcci alla colorazione a fluorescenza multiplex che possono essere eseguiti contemporaneamente o in sequenza. Nel metodo di colorazione simultanea, tutti gli anticorpi vengono aggiunti insieme come cocktail in un unico passaggio per etichettare il tessuto. La tecnologia UltraPlex utilizza un cocktail di anticorpi primari coniugati seguiti da un cocktail di anticorpi secondari anti-hapten anti-hapten confluito con fluoroforo. La tecnologia InSituPlex⁸ utilizza un cocktail di anticorpi primari coniugati in DNA unici che vengono aggiunti contemporaneamente al tessuto seguito da un passo di amplificazione e infine sonde coniugate a fluoroforo che sono complementari a ogni sequenza di DNA unica sull’anticorpo primario. Entrambe queste tecnologie consentono il rilevamento di quattro marcatori più 4′,6-diamino-2-fenilindole (DAPI) per la colorazione nucleare. Altri due approcci per la colorazione multiplex simultanea si basano sulla spettrometria di massa iomaci^{secondaria 9}. Hyperion Imaging System utilizza la citometria di massa¹⁰ per rilevare fino a 37 marcatori. Questa tecnologia utilizza un cocktail di anticorpi coniugati in metallo per macchiare i tessuti, e specifiche aree dei tessuti sono ablatate da un laser e trasferite in un citometro di massa dove vengono rilevati gli ioni metallici. Un’altra tecnologia simile è l’IONPath, che utilizza la tecnologia di imaging del fascio di ioni multiplexed¹¹. Questa tecnologia utilizza uno strumento di spettrometria di massa modificato e una fonte di ioni di ossigeno invece del laser per ablate gli anticorpi coniugati in metallo. Mentre tutti questi approcci di colorazione multiplex simultanei consentono il rilevamento di più marcatori, i costi per coniugare DNA, apteni o metalli agli anticorpi, la perdita di tessuto a causa dell’ablazione e l’estesa elaborazione delle immagini per lo smistamento non possono essere sottovalutati. Inoltre, i kit e i protocolli di colorazione sono attualmente disponibili solo per i tessuti FFPE e lo sviluppo di pannelli personalizzati comporta tempi e spese aggiuntivi.

Il metodo di colorazione multiplex sequenziale, al contrario, include l’etichettatura del tessuto con un anticorpo a un marcatore, stripping per rimuovere l’anticorpo, seguita da ripetizioni sequenziali di questo processo per etichettare più marcatori¹². L’amplificazione del segnale di tirofa (TSA) è il metodo di multiplexing sequenziale più utilizzato. Altre due tecnologie di multiplexing utilizzano una combinazione di metodi di colorazione simultanei e sequenziali. La piattaforma CODEX¹³ impiega un cocktail di anticorpi coniugati a sequenze uniche di oligonucleotidi di DNA che alla fine vengono etichettate con un fluoroforo utilizzando una fase di polimerizzazione indicizzata seguita dall’imaging, dallo stripping e dalla ripetizione del processo per rilevare fino a 50 marcatori. L’approccio di colorazione multiplex MultiOmyx¹⁴ è un’iterazione di colorazione con un cocktail di tre o quattro anticorpi coniugati con fluoroforo, imaging, spegnimento dei fluorofori e ripetizione di questo ciclo per rilevare fino a 60 marcatori su una singola sezione. Simile al metodo di colorazione multiplex simultanea, mentre è possibile rilevare un’ampia gamma di marcatori, il tempo necessario per la colorazione, l’acquisizione dell’immagine, l’elaborazione e l’analisi è ampio. La fase di stripping/spegnimento comporta il riscaldamento e/o lo sbiancamento del campione di tessuto e, pertanto, l’approccio di colorazione multiplex sequenziale viene comunemente eseguito sui tessuti FFPE che mantengono l’integrità dei tessuti al riscaldamento o allo sbiancamento.

La fissazione della formalina e il successivo incorporamento della paraffina vengono prontamente eseguiti in un ambiente clinico, i blocchi di tessuto sono facili da memorizzare e sono disponibili diversi protocolli di colorazione multiplex. Tuttavia, l’elaborazione, l’incorporamento e la deparaffinazione dei tessuti FFPE, così come il recupero dell’antigene¹⁵, un processo attraverso il quale gli anticorpi possono accedere meglio agli epitopi, richiede molto tempo. Inoltre, l’elaborazione coinvolta nei tessuti FFPE contribuisce all’autofluorescenza¹⁶ e maschera gli epitopi bersaglio, con conseguente variabilità e mancanza di clone di anticorpi disponibili per rilevare gli antigeni nei tessuti FFPE^17,18,19. Un esempio è l’antigene di leucocito umano (HLA) di classe I alleli²⁰. Al contrario, lo scatto di congelamento dei tessuti non comporta lunghe fasi di elaborazione prima o dopo il fissaggio, eludendo la necessità di recupero dell’antigene^21,22e rendendolo vantaggioso per rilevare una più ampia gamma di obiettivi. Pertanto, l’utilizzo di tessuti congelati per l’imaging a fluorescenza multispettrale può essere utile per rilevare obiettivi per studi preclinici e clinici.

Date le limitazioni di cui sopra quando si utilizzano tessuti FFPE, ci siamo chiesti se l’imaging a fluorescenza multispettrale può essere eseguito su tessuti congelati. Per rispondere a questa domanda, abbiamo testato un metodo di colorazione multiplex simultaneo utilizzando un pannello di anticorpi coniugati a fluoroforo per rilevare più antigeni e analizzato la colorazione utilizzando un sistema di imaging multispettrale semiautomatico. Siamo stati in grado di macchiare simultaneamente fino a sei marcatori in una singola sezione di tessuto entro 90 min.