Une méthode rapide pour l’imagerie multispectrale de fluorescence des sections de tissu congelé

Les progrès récents dans les techniques d’imagerie microscopique ont considérablement amélioré nos connaissances et notre compréhension des processus biologiques et des états pathologiques. La détection in situ des protéines dans les tissus par immunohistochimie chromogénique (IHC) est régulièrement effectuée en pathologie. Cependant, la détection de marqueurs multiples utilisant la coloration chromogénique de LHC est difficile¹ et de nouvelles méthodes pour employer des approches de coloration d’immunofluorescence multiplex (mIF), où plusieurs marqueurs biologiques sont étiquetés sur un seul échantillon de tissu, sont en cours de développement. La détection de marqueurs biologiques multiples est utile, parce que les informations liées à l’architecture des tissus, la distribution spatiale des cellules, et la co-expression des antigènes sont tous capturés dans un seul échantillon de tissu². L’utilisation de la technologie d’imagerie par fluorescence multispectrale a rendu possible la détection de plusieurs marqueurs biologiques. Dans cette technologie, en utilisant des optiques spécifiques les spectres de fluorescence de chaque fluorophore individuel peuvent être séparés ou «non mélangés», permettant la détection de marqueurs multiples sans aucune traque spectrale³. L’imagerie multispectrielle de fluorescence devient une approche critique dans la biologie cellulaire, le développement préclinique de drogue, la pathologie clinique, et le profilage immunitaire de tumeur^4,,5,6. Fait important, la distribution spaciale des cellules immunitaires (en particulier les lymphocytes T CD8) peut servir de facteur pronostique pour les patients atteints de tumeurs existantes⁷.

Diverses approches de coloration de fluorescence multiplex ont été développées et peuvent être effectuées simultanément ou séquentiellement. Dans la méthode de coloration simultanée, tous les anticorps sont ajoutés ensemble comme un cocktail en une seule étape pour étiqueter le tissu. La technologie UltraPlex utilise un cocktail d’anticorps primaires conjugués à l’hapten, suivi d’un cocktail d’anticorps secondaires anti-hapten conjugués au fluorophore. InSituPlex technology⁸ utilise un cocktail d’anticorps primaires conjugués à l’ADN uniques qui sont simultanément ajoutés au tissu suivis d’une étape d’amplification et enfin de sondes épurées au fluorophore qui sont complémentaires à chaque séquence d’ADN unique sur l’anticorps primaire. Ces deux technologies permettent la détection de quatre marqueurs plus 4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) pour la coloration nucléaire. Deux autres approches pour la coloration simultanée de multiplex sont basées sur la spectrométrie secondaire de masse d’ion⁹. Le système d’imagerie Hyperion utilise la cytométrie de masse^{d’imagerie 10} pour détecter jusqu’à 37 marqueurs. Cette technologie utilise un cocktail d’anticorps conjugués au métal pour tacher les tissus, et des zones spécifiques des tissus sont ablés par un laser et transférées à un cytomètre de masse où les ions métalliques sont détectés. Une autre technologie similaire est l’IONPath, qui utilise la technologie d’imagerie à faisceau d’ions multiplexed¹¹. Cette technologie utilise un instrument de spectrométrie de masse modifié et une source d’ions d’oxygène au lieu d’un laser pour abler les anticorps conjugués au métal. Bien que toutes ces approches simultanées de coloration multiplexe permettent la détection de marqueurs multiples, les coûts impliqués pour conjuguer l’ADN, les haptens ou les métaux aux anticorps, la perte de tissu due à l’ablation, et le traitement d’image étendu pour le semage ne peut pas être sous-estimé. En outre, les kits et les protocoles de coloration ne sont actuellement disponibles que pour les tissus FFPE et le développement de panneaux personnalisés implique plus de temps et de dépenses.

La méthode séquentielle de coloration multiplex, en revanche, comprend l’étiquetage du tissu avec un anticorps à un marqueur, le décapage pour enlever l’anticorps, suivi par des répétitions séquentielles de ce processus pour étiqueter plusieurs marqueurs¹². L’amplification du signal de tyramide (TSA) est la méthode de multiplexe séquentielle la plus fréquemment utilisée. Deux autres technologies de multiplexage utilisent une combinaison de méthodes de coloration simultanées et séquentielles. La plate-forme CODEX¹³ utilise un cocktail d’anticorps conjugués à des séquences uniques d’oligonucléotide d’ADN qui sont finalement étiquetés avec un fluorophore à l’aide d’une étape de polymérisation indexée suivie de l’imagerie, le décapage et la répétition du processus pour détecter jusqu’à 50 marqueurs. L’approche de coloration multiplexe MultiOmyx¹⁴ est une itération de colorant avec un cocktail de trois à quatre anticorps fluorophore-conjugués, imagerie, étanchéité des fluorophores, et répétant ce cycle pour détecter jusqu’à 60 marqueurs sur une seule section. Semblable à la méthode simultanée de coloration multiplex, tandis qu’un large éventail de marqueurs peuvent être détectés, le temps impliqué dans la coloration, l’acquisition d’image, le traitement, et l’analyse est étendu. L’étape de décapage/étanchéité consiste à chauffer et/ou à blanchir l’échantillon de tissu et, par conséquent, l’approche séquentielle de coloration multiplexe est couramment pratiquée sur les tissus ffPE qui maintiennent l’intégrité des tissus lors du chauffage ou du blanchiment.

La fixation de formaline et l’intégration subséquente de paraffine sont facilement exécutées dans un arrangement clinique, les blocs de tissu sont faciles à stocker, et plusieurs protocoles de coloration de multiplexe sont disponibles. Cependant, le traitement, l’intégration et la deparaffinisation des tissus FFPE, ainsi que la récupération d’antigène¹⁵, un processus par lequel les anticorps peuvent mieux accéder aux épitopes, prend beaucoup de temps. En outre, le traitement impliqué dans les tissus FFPE contribue à l’autofluorescence¹⁶ et les masques ciblent les épitopes, résultant en la variabilité et le manque de clone d’anticorps disponibles pour détecter les antigènes dans les tissus FFPE^17,18,19. Un exemple est l’antigène leucocyte humain (HLA) classe I allèles²⁰. En revanche, la congélation rapide des tissus n’implique pas d’étapes de traitement étendues avant ou après la fixation, contournant le besoin de récupération d’antigène^21,22, et le rendant bénéfique pour détecter un plus large éventail de cibles. Par conséquent, l’utilisation de tissus congelés pour l’imagerie multispectrale de fluorescence peut être utile pour détecter des cibles pour des études précliniques et cliniques.

Étant donné les limites mentionnées ci-dessus lors de l’utilisation des tissus FFPE, nous avons demandé si l’imagerie multispectrale de fluorescence peut être effectuée sur les tissus congelés. Pour répondre à cette question, nous avons testé une méthode simultanée de coloration multiplexe à l’aide d’un panel d’anticorps fluorophore-conjugués pour détecter de multiples antigènes et analysé la coloration à l’aide d’un système d’imagerie multispectral semi-automatique. Nous avons pu tacher simultanément jusqu’à six marqueurs dans une seule section tissulaire dans un rayon de 90 min.