طريقة سريعة لتصوير الفلورسينس متعدد الأطياف لأقسام الأنسجة المجمدة

وقد أدت التطورات الأخيرة في تقنيات التصوير المجهري إلى تحسين معرفتنا وفهمنا للعمليات البيولوجية وحالات المرض بشكل كبير. في الموقع الكشف عن البروتينات في الأنسجة عن طريق الكيمياء المناعية الكروميوم (IHC) يتم بشكل روتيني في علم الأمراض. ومع ذلك ، فإن الكشف عن علامات متعددة باستخدام تلطيخ Chromogenic IHC يشكل^{تحديًا 1} ويتم تطوير طرق أحدث لاستخدام أساليب تلطيخ الفلور المناعي (mIF) متعددة ، حيث يتم وضع علامات بيولوجية متعددة على عينة نسيج واحد. الكشف عن علامات بيولوجية متعددة مفيد، لأن المعلومات المتعلقة بهندسة الأنسجة، والتوزيع المكاني للخلايا، والتعبير المشترك للمستضد يتم التقاطها جميعها في عينة نسيج واحد². وقد جعل استخدام تكنولوجيا التصوير الفلورية المتعددة الأطياف الكشف عن علامات بيولوجية متعددة ممكناً. في هذه التكنولوجيا، وذلك باستخدام بصريات محددة يمكن فصل أطياف الفلورسينس لكل فلوروفور الفردية أو “غير مختلطة”، مما يتيح الكشف عن علامات متعددة دون أي تقاطع الطيفية³. التصوير الفلوري متعدد الأطياف أصبح نهجا حاسما في بيولوجيا الخلايا، وتطوير الأدوية قبل السريرية، وعلم الأمراض السريرية، والورم المناعة التنميط^4،5،6. الأهم من ذلك، يمكن أن يكون التوزيع السباسي للخلايا المناعية (على وجه التحديد خلايا CD8 T) بمثابة عامل تشخيصي للمرضى الذين يعانون من الأورام الموجودة⁷.

وقد وضعت أساليب مختلفة لتلطيخ الفلورسين المتعدد ويمكن القيام به إما في وقت واحد أو بالتسلسل. في طريقة تلطيخ في وقت واحد، يتم إضافة جميع الأجسام المضادة معا ككوكتيل في خطوة واحدة لتسمية الأنسجة. تستخدم تقنية UltraPlex مزيجًا من الأجسام المضادة الأولية النتنة متبوعة يليها مزيج من الأجسام المضادة الثانوية المضادة للنتن المترافقة مع الفلوروفور. InSituPlex التكنولوجيا⁸ يستخدم مزيجا من الأجسام المضادة الفريدة الحمض النووي الاقتران الأولية التي تضاف في وقت واحد إلى الأنسجة تليها خطوة التضخيم وأخيرا المخارج الفلوروفور مترافق التي هي مكملة لكل تسلسل الحمض النووي فريدة من نوعها على الأجسام المضادة الأولية. كل من هذه التكنولوجيات تمكن من الكشف عن أربع علامات بالإضافة إلى 4’،6-diamino-2-phenylindole (DAPI) للتلطيخ النووي. ويستند نهجين آخرين لتلطيخ متعددة في وقت واحد على الطيف كتلة الأيون الثانوية⁹. يستخدم نظام التصوير Hyperion قياس الخلايا الشامل التصوير¹⁰ للكشف عن ما يصل إلى 37 علامة. تستخدم هذه التقنية مزيجًا من الأجسام المضادة المعدنية المترافقة لتلطيخ الأنسجة ، ويتم تشعب مناطق محددة من الأنسجة بالليزر ونقلها إلى مقياس سيتومتر جماعي حيث يتم اكتشاف الأيونات المعدنية. آخر مماثلة التكنولوجيا هو IONPath، الذي يستخدم متعددة الأيون شعاع تكنولوجيا التصوير¹¹. تستخدم هذه التقنية أداة قياس الطيف الكتلي المعدلة ومصدر أيون الأكسجين بدلاً من الليزر لإزالة الأجسام المضادة المعدنية المترافقة. في حين أن كل هذه النهج المتعددة المتزامنة تلطيخ تمكين الكشف عن علامات متعددة، لا يمكن التقليل من التكاليف التي ينطوي عليها لاقتران الحمض النووي، التعاز، أو المعادن إلى الأجسام المضادة، وفقدان الأنسجة بسبب الاجتثاث، ومعالجة الصور واسعة النطاق لعدم الاختلاط. وعلاوة على ذلك، لا تتوفر حاليا ً مجموعات وبروتوكولات تلطيخ إلا لأنسجة FFPE وينطوي تطوير لوحات مخصصة على وقت ونفقات إضافية.

طريقة تلطيخ متعددة متتابعة، في المقابل، تشمل وضع علامة على الأنسجة مع الأجسام المضادة لعلامة واحدة، وتجريد لإزالة الأجسام المضادة، تليها تكرار متتابعة لهذه العملية لتسمية علامات متعددة¹². إن تضخيم إشارة التيراميد (TSA) هو الأسلوب متعدد الإرسال التسلسلي الأكثر استخدامًا. تستخدم اثنين من التقنيات متعددة أخرى متعددة مزيج من أساليب تلطيخ متزامنة ومتتابعة. تستخدم منصة CODEX¹³ مزيجًا من الأجسام المضادة المترافقة مع تسلسلoligonucleotide النووي الفريد الذي يتم تصنيفه في نهاية المطاف بفلوريفوروفور باستخدام خطوة بلمرة مفهرسة يتبعها التصوير والتجريد وتكرار العملية للكشف عن ما يصل إلى 50 علامة. نهج تلطيخ MultiOmyx متعددة¹⁴ هو تكرار للتلطيخ مع مزيج من ثلاثة إلى أربعة الأجسام المضادة المفلورة الزوجية ، والتصوير ، وإرواء الفلوروفوريات ، وتكرار هذه الدورة للكشف عن ما يصل إلى 60 علامة على مقطع واحد. على غرار طريقة تلطيخ متعددة في وقت واحد ، في حين يمكن الكشف عن مجموعة واسعة من العلامات ، فإن الوقت الذي ينطوي عليه تلطيخ ، وحيازة الصور ، والمعالجة ، والتحليل واسع النطاق. تتضمن خطوة التجريد /التروية التدفئة و / أو تبييض عينة الأنسجة ، وبالتالي ، يتم تنفيذ نهج تلطيخ متعدد الموجات المتسلسلة عادة على أنسجة FFPE التي تحافظ على سلامة الأنسجة عند التدفئة أو التبييض.

يتم تنفيذ التثبيت الرسمي وتضمين البارافين اللاحق بسهولة في بيئة سريرية ، وكتل الأنسجة سهلة التخزين ، وتتوفر العديد من بروتوكولات تلطيخ متعددة. ومع ذلك ، فإن معالجة وتضمين وإزالة الأنسجة FFPE ، وكذلك استرجاع المستضد¹⁵، وهي عملية يمكن من خلالها للأجسام المضادة الوصول بشكل أفضل إلى epitopes ، تستغرق وقتًا طويلاً. وعلاوة على ذلك، فإن المعالجة التي تنطوي عليها أنسجة FFPE يساهم في autofluorescence¹⁶ والأقنعة الهدف epitopes، مما أدى إلى تقلب وعدم وجود استنساخ الأجسام المضادة المتاحة للكشف عن المستضدات في أنسجة FFPE^17،18،19. مثال على ذلك هو مستضد الكريات البيض البشرية (HLA) فئة I alleles²⁰. في المقابل، لا ينطوي التجميد المفاجئة للأنسجة على خطوات معالجة واسعة النطاق قبل أو بعد التثبيت، والتحايل على الحاجة إلى استرجاع المستضد^21،22، وجعله مفيدًا للكشف عن نطاق أوسع من الأهداف. لذلك ، يمكن أن يكون استخدام الأنسجة المجمدة لتصوير الفلورسينس متعدد الأطياف قيمًا للكشف عن أهداف الدراسات قبل السريرية والسريرية.

وبالنظر إلى القيود المذكورة أعلاه عند استخدام أنسجة FFPE، سألنا عما إذا كان يمكن إجراء التصوير الفلوري المتعدد الأطياف على الأنسجة المجمدة. لمعالجة هذا السؤال، اختبرنا طريقة تلطيخ متعددة في وقت واحد باستخدام لوحة من الأجسام المضادة المفلورة الزوجية للكشف عن مستضدات متعددة وحللنا تلطيخ باستخدام نظام تصوير متعدد الأطياف الآلية. تمكنا من تلطيخ ما يصل إلى ست علامات في قسم نسيج واحد في غضون 90 دقيقة.