Визуализация и анализ фарингиальных архиерейных артерий с использованием иммуногистохимии и 3D-реконструкции
Summary
Здесь мы описываем протокол для визуализации и анализа фарингиальных арочных артерий 3, 4 и 6 эмбрионов мыши с использованием иммунофлуоресценции, очистки тканей, конфокальной микроскопии и 3D-реконструкции.
Abstract
Неправильное образование или реконструкция фарингиальных архи-артерий (PAAs) 3, 4 и 6 способствуют некоторым из наиболее тяжелых форм врожденных пороков сердца. Для изучения формирования ПАО мы разработали протокол с использованием цельномонтажной иммунофлуоресценции в сочетании с бензиловым спиртом/бензил бензоатом (BABB) очисткой тканей и конфокальной микроскопией. Это позволяет визуализировать фарингиальную арку эндотелия при тонком клеточном разрешении, а также 3D-соединение сосуды. Используя программное обеспечение, мы создали протокол для количественной оценки количества эндотелиальных клеток (ECs) в PAAs, а также количество ЭК в сосудистом сплетении, окружающих PAA в пределах фаринговых арок 3, 4 и 6. При применении ко всему эмбриону, эта методология обеспечивает комплексную визуализацию и количественный анализ эмбриональных сосуд.
Introduction
Во время эмбрионеза мыши, фарингеальные арочные артерии (PAAs) возникают как симметричные, двусторонние пары артерий, которые соединяют сердце с дорсальной аорты1. По мере развития эмбриона, первая и вторая пары PAAs регресс, в то время как3-й,4-й,и6-й PAA проходят серию асимметричных событий реконструкции для формирования аортальных артерий арки2.
PAAs 3, 4 и 6 развиваются через васкулогенез, который является де Ново формирование кровеносных сосудов3. Дефекты в формировании или ремоделирования этих арочных артерий приводят к различным врожденным порокам сердца, таким как те, которые наблюдаются у пациентов с синдромом ДиДжорджа4,5. Таким образом, понимание механизмов, которые регулируют развитие PAAs может привести к лучшему пониманию врожденных пороков сердца (ИГП) этиологии.
Текущие подходы для визуализации и анализа развития PAA включают иммунофлуоресценцию тканей, сосудистых слепков, инъекции чернил Индии, епископальной микроскопии высокого разрешения, и/или цельномонтаж иммуногистохимии1,4,,5,,6,7. В этом мы описываем протокол, сочетающий в себе иммунофлуоресценцию, конфокальные микроскопии и 3D-визуализацию изображений для сбора, анализа и количественной оценки объемных данных, сосудистой связи и клеточной идентичности. Кроме того, мы подробно метод разобщить и количественно номера eCs в каждой фарингиальной арки в качестве средства для изучения формирования фарингеальной арки сосудистого сплетения и его ремоделирования в PAAs. Хотя этот протокол предназначен для анализа развития PAA, он может быть использован для анализа других развивающихся сосудистых сетей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Возможность визуализировать эндотелий в эмбрионах мыши в 3D предоставила новые идеи в их развитии3. Здесь мы представляем протокол, который позволяет с высоким разрешением 3D-изображения эмбрионов, визуализации сосудистой связи, а также количественный анализ формирования P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Брианну Александр, Каолан О’Доннелл и Майкла Варкалу за тщательное чтение и редактирование этой рукописи. Эта работа была поддержана финансированием из Национального института сердца, легких и крови NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 в SA; AJR поддерживается NHLBI HL103920-08S1 и Национальным институтом артрита и опорно-мостомузыка и кожных заболеваний Учебный грант T32052283-11.
Materials
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
References
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
- Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).
- Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
- Weninger, W., et al. Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).
- Phillips, H. M., et al. Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis. Development. 146 (18), (2019).
- Vlaeminck-Guillem, V., et al. The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
