Visualização e Análise de Artérias ariníngeos usando Imunohistoquímica de montagem integral e Reconstrução 3D
Summary
Aqui, descrevemos um protocolo para visualizar e analisar as artérias do arco faríngeo 3, 4 e 6 dos embriões de camundongos usando imunofluorescência de montagem total, limpeza de tecidos, microscopia confocal e reconstrução 3D.
Abstract
A formação inadequada ou a remodelação das artérias do arco faríngeo (PAAs) 3, 4 e 6 contribuem para algumas das formas mais graves de doença cardíaca congênita. Para estudar a formação de PAAs, desenvolvemos um protocolo utilizando imunofluorescência de montagem completa juntamente com a limpeza de tecido de álcool benzílico/benzoato de benzílico (BABB) e microscopia confocal. Isso permite a visualização do endotélio do arco faríngeo em uma resolução celular fina, bem como a conectividade 3D da vasculatura. Usando software, estabelecemos um protocolo para quantificar o número de células endoteliais (CEIs) em PAAs, bem como o número de CE dentro do plexo vascular em torno dos PAAs dentro dos arcos faríngea3, 4 e 6. Quando aplicada a todo o embrião, essa metodologia proporciona uma visualização abrangente e análise quantitativa da vasculatura embrionária.
Introduction
Durante a embriogênese do camundongo, as artérias arqueína faríngeas (PAAs) surgem como pares bilaterais simétricos de artérias que conectam o coração com a aortae dorsal1. À medida que o embrião se desenvolve, o primeiro e o segundo pares de PAAs regredem, enquanto os3º,4ºe6º PAAs passam por uma série de eventos de remodelação assimétrica para formar as artérias arqueoréticas2.
Os PAAs 3, 4 e 6 desenvolvem-se através da vasculogênese, que é a formação de novo dos vasos sanguíneos3. Defeitos na formação ou remodelação dessas artérias arqueais dão origem a vários defeitos cardíacos congênitos, como os observados em pacientes com Síndrome de DiGeorge4,5. Portanto, a compreensão de mecanismos que regulam o desenvolvimento de PAAs pode levar a uma melhor compreensão da etiologia da doença cardíaca congênita (CHD).
As abordagens atuais para visualizar e analisar o desenvolvimento do PAA incluem imunofluorescência de seções teciduais, moldes vasculares, injeção de tinta índia, microscopia episcópica de alta resolução e/ou imunohistoquímica de montagem total1,,4,,5,6,7. Aqui, descrevemos um protocolo que combina imunofluorescência total, microscopia confocal e renderização de imagem 3D, a fim de coletar, analisar e quantificar dados volumétricas, conectividade vascular e identidade celular. Além disso, detalhamos um método para compartimentar e quantificar os números de CE em cada arco faríngeo como forma de estudar a formação do plexo vascular do arco faríngeo e sua remodelação nos PAAs. Embora este protocolo seja projetado para analisar o desenvolvimento do PAA, ele pode ser usado para analisar outras redes vasculares em desenvolvimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
A capacidade de visualizar o endotélio em embriões de camundongos em 3D forneceu novas percepções sobre seu desenvolvimento3. Aqui apresentamos um protocolo que permite imagens 3D de alta resolução de embriões, visualização da conectividade vascular e análises quantitativas da formação de PAA. Este protocolo pode ser empregado para ver como alterações genéticas ou insultos ambientais afetam o desenvolvimento do PAA. O procedimento aqui relatado utiliza anticorpos contra VEGFR2 e ERG…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Brianna Alexander, Caolan O’Donnell e Michael Warkala pela leitura e edição cuidadosa deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do National Heart, Lung and Blood Institute do NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 para SA; A AJR é apoiada pelo NHLBI HL103920-08S1 e pelo Instituto Nacional de Artrite e Treinamento de Doenças Musculoesqueléticas e de Pele grant T32052283-11.
Materials
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
References
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