全実装免疫学化学と3D再構成を用いた咽頭弓動脈の可視化と解析
Summary
ここでは、全実装免疫蛍光、組織クリア、共焦点顕微鏡、3D再構成を用いて、咽頭弓動脈3、4、および6個のマウス胚を可視化・解析するプロトコルについて述べている。
Abstract
咽頭弓動脈(PAA)3、4、および6の不適切な形成または改修は、先天性心疾患の最も重篤な形態のいくつかに寄与する。PAAの形成を研究するために、ベンジルアルコール/ベンジルベンゾアート(BABB)組織クリアリングと共焦点顕微鏡を組み合わせた全実装免疫蛍光を用いたプロトコルを開発した。これにより、細かい細胞分解能で咽頭のアーチ内皮を可視化し、血管構造の3D接続性を可能にします。ソフトウェアを用いて、PAA内の内皮細胞(IC)の数、咽頭アーチ3、4、および6内のPAAを取り巻く血管叢内のICの数を定量化するプロトコルを確立しました。胚全体に適用される場合、この方法論は胚脈管構造の包括的な視覚化および定量的分析を提供する。
Introduction
マウスの胚発生時に、咽頭弓動脈(PAA)は、心臓と後部大動脈1を結ぶ対称的な二側側の動脈対として生じる。胚が発達するにつれて、PAAの第1および第2のペアは後退し、第3、第4、および第6のPAAは大動脈動脈を形成する一連の非対称リモデリングイベントを受ける2。
PAA 3,4,6は血管形成を介して発達し、血管形成3.これらのアーチ動脈の形成または改造における欠陥は、ディジョージ症候群4、5の患者に見られるような様々な先天性心不全を5引き起こす。したがって、PAAの発達を調節するメカニズムを理解することは、先天性心疾患(CHD)病因をよりよく理解することにつながる。
PAA開発を可視化および分析するための現在のアプローチとしては、組織切片の免疫蛍光、血管キャスト、インドのインク注入、高解像度のエピスコピック顕微鏡、および/または全実装免疫組織化学11、4、5、6、74,5,6,が挙げられる。ここでは、体積データ、血管接続性、細胞アイデンティティを収集、解析、定量化するために、全実装免疫蛍光、共焦点顕微鏡、3D画像レンダリングを組み合わせたプロトコルについて説明する。さらに、咽頭弓血管叢の形成とPAAへの改修を研究する手段として、各咽頭弓中のICの数を区分化し定量化する方法を詳述する。このプロトコルはPAAの開発を分析するために設計されていますが、他の発達中の血管ネットワークを分析するために使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
3Dでマウス胚の内皮を可視化する能力は、その発達に新たな洞察を提供しました 3.ここでは、胚の高解像度3Dイメージング、血管接続の可視化、およびPAA形成の定量的分析を可能にするプロトコルを提示する。このプロトコルは、遺伝的変化または環境侮辱がPAAの発達にどのような影響を与えるかを確認するために使用することができます。ここで報告された手順は、VEGFR2お…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿を丁寧に読んで編集してくれたブリアナ・アレクサンダー、カオラン・オドネル、マイケル・ワルカラに感謝します。この研究は、NIH R01 HL103920、R01 HL134935、R21 OD025323-01からSAへの国立心臓、肺および血液研究所からの資金提供によって支えられた。AJRは、NHLBI HL103920-08S1および国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所トレーニング助成金T32052283-11によってサポートされています。
Materials
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
References
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