הדמיה וניתוח עורקי קשת והלוע באמצעות שחזור-הר אימונוהיסטוכימיה ותלת מימד
Summary
כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי להמחיש ולנתח את העורקים קשת הלוע 3, 4, ו 6 עוברי העכבר באמצעות החיסונית של הר שלמים, ניקוי רקמות, מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, ו-3d שחזור.
Abstract
היווצרות לא תקין או שיפוץ של העורקים קשת הלוע (PAAs) 3, 4, ו 6 לתרום כמה צורות חמורות ביותר של מחלת לב מולדים. כדי ללמוד את היווצרות של paas, פיתחנו פרוטוקול באמצעות שימוש מלא החיסונית של האנטי-משתמשים בשילוב עם בנזיל אלכוהול/בנזוקסיל (babb) ניקוי רקמות, ו מיקרוסקופ קונפוקלית וקדי. הדבר מאפשר הדמיה של קשת הלוע ברזולוציה תאית משובחת, כמו גם את הקישוריות 3D של ואצלב. באמצעות תוכנה, הקמנו פרוטוקול לכמת את מספר תאי האנדותל (ECs) ב PAAs, כמו גם את מספר ECs בתוך מקלעת כלי הדם המקיפים את PAAs בתוך קשתות הלוע 3, 4, ו 6. כאשר הוא מיושם על כל העובר, מתודולוגיה זו מספקת הדמיה מקיפה וניתוח כמותי של ואצלב עובריים.
Introduction
במהלך הembryogenesis העכבר, העורקים קשת של הלוע (PAAs) להתעורר כמו סימטרי, דו צדדי העורקים של עורק המחברים את הלב עם aortae1. כאשר העובר מתפתח, הזוג הראשון והשני של הסגת הדרך של PAAs, בעודהשלישי, 4th, ו-6ה paas לעבור סדרה של אירועים שיפוץ סימטרי כדי ליצור את העורקים קשת של אבי העורקים2.
PAAs 3, 4 ו 6 להתפתח באמצעות vasculogenesis, שהוא היווצרות דה נובו של כלי הדם3. פגמים בהיווצרות או שיפוץ של עורקי קשת אלה להצמיח מומים לב מולדים שונים, כמו אלה שנראו בחולים עם תסמונת digeorge4,5. לכן, הבנת מנגנונים המסדירים את ההתפתחות של PAAs יכול להוביל להבנה טובה יותר של מחלת לב מולדים (CHD) האטיולוגיה.
גישות נוכחיות להמחיש ולנתח צפות פיתוח כוללים immunofluorescence מפרקים רקמות, כלי דם, הזרקת דיו הודו, מיקרוסקופ האפיסקופלית ברזולוציה גבוהה, ו/או שלמים-הר אימונוהיסטוכימיה1,4,5,6,7. להלן, אנו מתארים פרוטוקול המשלב המכלול שילוב של החיסונית, המיקרוסקופיה ועיבוד תמונה תלת-ממדית כדי לאסוף, לנתח, ולכמת נתונים נפחי, קישוריות כלי דם וזהות התא. עוד, אנו לפרט שיטה למדר ולכמת את המספרים של ECs בכל קשת הלוע כאמצעי ללמוד היווצרות של קשת הלוע מקלעת כלי הדם ואת שיפוץ לתוך PAAs. בעוד פרוטוקול זה מיועד לניתוח פיתוח צפות, ניתן להשתמש בו כדי לנתח אחרים לפיתוח רשתות כלי דם.
Protocol
Representative Results
Discussion
היכולת להמחיש את האנדותל של עוברי העכבר ב-3D סיפקה תובנות חדשות לפיתוח שלהם3. כאן אנו מציגים פרוטוקול המאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה תלת-ממד של עוברים, ויזואליזציה של קישוריות כלי דם, וניתוחים כמותיים של היווצרות צפות. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק כדי לראות כיצד שינויים גנטיים א?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לבריאנה אלכסנדר, קאולן אודונל ומייקל וורקאלה לקריאה זהירה ועריכה של כתב יד זה. עבודה זו נתמכת על ידי המימון של הלב הלאומי, ריאות ודם המכון של NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 ל-SA; AJR נתמך על ידי NHLBI HL103920-08S1 ואת המכון הלאומי של דלקת מפרקים והשלד ומחלות עור הדרכה מענק T32052283-11.
Materials
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
References
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
- Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).
- Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
- Weninger, W., et al. Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).
- Phillips, H. M., et al. Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis. Development. 146 (18), (2019).
- Vlaeminck-Guillem, V., et al. The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
