Visualisation et analyse des artères pharyngées à l’aide de l’immunohistochimie à monture entière et de la reconstruction 3D
Summary
Ici, nous décrivons un protocole pour visualiser et analyser les artères pharyngées d’arc 3, 4, et 6 des embryons de souris utilisant l’immunofluorescence entière de montage, le dégagement de tissu, la microscopie confocale, et la reconstruction 3D.
Abstract
La formation ou le remodelage inadéquats des artères d’arc pharyngée (PAAs) 3, 4 et 6 contribuent à certaines des formes les plus graves de maladie cardiaque congénitale. Pour étudier la formation des APA, nous avons mis au point un protocole utilisant l’immunofluorescence à monture entière couplée à l’élimination des tissus de l’alcool et du benzyl benzylo (BABB) et à la microscopie confocale. Cela permet la visualisation de l’endothélium d’arc pharyngé à une résolution cellulaire fine ainsi que la connectivité 3D de la vascularisation. À l’aide d’un logiciel, nous avons établi un protocole pour quantifier le nombre de cellules endothéliales (CE) dans les APE, ainsi que le nombre d’EC dans le plexus vasculaire entourant les APA dans les arcs pharyngés 3, 4 et 6. Lorsqu’elle est appliquée à l’ensemble de l’embryon, cette méthodologie fournit une visualisation complète et une analyse quantitative de la vascularisation embryonnaire.
Introduction
Pendant l’embryogenèse de souris, les artères d’arc pharyngées (PAA) apparaissent comme des paires symétriques et bi-latérales d’artères qui relient le coeur avec l’aortae dorsale1. Au fur et à mesure que l’embryon se développe, les premières et deuxièmes paires de PAAs régressent, tandis que les 3rd,4eet 6e PAAs subissent une série d’événements asymétriques de remodelage pour former les artères aortiques de l’arc2.
Les PAA 3, 4 et 6 se développent via la vasculogenèse, qui est la formation de novo des vaisseaux sanguins3. Les défauts dans la formation ou le remodelage de ces artères d’arc donnent lieu à diverses malformations cardiaques congénitales, telles que celles vues dans les patients présentant le syndrome de DiGeorge4,5. Par conséquent, la compréhension des mécanismes qui réglementent le développement des APA peut mener à une meilleure compréhension de l’étiologie congénitale des maladies cardiaques (CHD).
Les approches actuelles pour visualiser et analyser le développement de l’AAP comprennent l’immunofluorescence des sections tissulaires, les moulages vasculaires, l’injection d’encre en Inde, la microscopie épiscopique à haute résolution, et/ou l’immunohistochimie à monture entière1,4,5,6,7. Ici, nous décrivons un protocole combinant l’immunofluorescence de monté entière, la microscopie confocale et le rendu d’image 3D afin de recueillir, d’analyser et de quantifier des données volumétriques, la connectivité vasculaire et l’identité cellulaire. En outre, nous détaillons une méthode pour compartimenter et quantifier le nombre de CE dans chaque arc pharyngeal comme un moyen d’étudier la formation du plexus vasculaire d’arc pharyngé et son remodelage dans les PAA. Bien que ce protocole soit conçu pour analyser le développement de l’AAP, il peut être utilisé pour analyser d’autres réseaux vasculaires en développement.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacité de visualiser l’endothélium dans les embryons de souris en 3D a fourni de nouvelles perspectives dans leur développement3. Nous présentons ici un protocole qui permet l’imagerie 3D haute résolution des embryons, la visualisation de la connectivité vasculaire et les analyses quantitatives de la formation de PAA. Ce protocole peut être utilisé pour voir comment les altérations génétiques ou les insultes environnementales influent sur le développement de l’AAP. La procé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Brianna Alexander, Caolan O’Donnell et Michael Warkala pour la lecture et l’édition minutieuses de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le financement de l’Institut national du cœur, du poumon et du sang des NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 à SA; L’AJR est appuyée par l’AJR HL103920-08S1 et la subvention de l’Institut national de formation de l’arthrite et des maladies musculo-squelettiques et des maladies de la peau T32052283-11.
Materials
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
References
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