Visualisatie en analyse van faryngeale boogslagaders met behulp van Whole-mount Immunohistochemie en 3D Reconstructie
Summary
Hier beschrijven we een protocol om de faryngeale boogslagaders 3, 4 en 6 muisembryo’s te visualiseren en te analyseren met behulp van immunofluorescentie, weefselclearing, confocale microscopie en 3D-reconstructie.
Abstract
Onjuiste vorming of remodelleren van de faryngeale boogslagaders (PAA’s) 3, 4 en 6 dragen bij aan enkele van de meest ernstige vormen van aangeboren hart-en vaatziekten. Om de vorming van PAA’s te bestuderen, ontwikkelden we een protocol met behulp van immunofluorescentie van de hele berg in combinatie met benzylalcohol/benzylbenzoaat (BABB) weefselclearing en confocale microscopie. Dit maakt de visualisatie van de faryngeale boog endotheel op een fijne cellulaire resolutie evenals de 3D-connectiviteit van de vasculatuur. Met behulp van software hebben we een protocol opgesteld om het aantal endotheelcellen (EV’s) in PAA’s te kwantificeren, evenals het aantal E’s in de vasculaire plexus rond de PAA’s binnen faryngeale bogen 3, 4 en 6. Wanneer toegepast op het hele embryo, biedt deze methodologie een uitgebreide visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale vasculatuur.
Introduction
Tijdens de embryogenese van de muis ontstaan faryngeale boogslagaders (PAA’s) als symmetrische, tweelaterale paren slagaders die het hart verbinden met de dorsaleaorta1. Naarmate het embryo zich ontwikkelt, de eerste en tweede paar PAA’s achteruit, terwijl de3e,4e, en 6e PAA’s ondergaan een reeks van asymmetrische remodelleren gebeurtenissen om de aortaboog slagaders te vormen2.
Paa’s 3, 4 en 6 ontwikkelen zich via vasculogene, dat is de de novo vorming van bloedvaten3. Afwijkingen in de vorming of remodelleren van deze boogslagaders leiden tot verschillende aangeboren hartafwijkingen, zoals die gezien bij patiënten met digeorge syndroom4,5. Daarom kan het begrijpen van mechanismen die de ontwikkeling van PAA’s reguleren leiden tot een beter begrip van aangeboren hart-en vaatziekten (CHD) etiologie.
De huidige benaderingen voor het visualiseren en analyseren van PAA-ontwikkeling omvatten immunofluorescentie van weefselsecties, vaatwerpt, India-inktinjectie, hoge resolutie episcopic microscopie en/of immunohistochemie aan de hele berg1,4,5,6,7. Hierin beschrijven we een protocol dat hele immunofluorescentie, confocale microscopie en 3D-beeldweergave combineert om volumetrische gegevens, vasculaire connectiviteit en celidentiteit te verzamelen, analyseren en kwantificeren. Verder detailleren we een methode om de aantallen EC’s in elke faryngeale boog te compartimenteren en te kwantificeren als een middel om de vorming van de faryngeale boog vasculaire plexus en de remodelleren ervan in de PAA’s te bestuderen. Hoewel dit protocol is ontworpen voor het analyseren van PAA-ontwikkeling, kan het worden gebruikt om andere zich ontwikkelende vasculaire netwerken te analyseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mogelijkheid om het endotheel in muisembryo’s in 3D te visualiseren heeft nieuwe inzichten opgeleverd in hun ontwikkeling3. Hier presenteren we een protocol dat het mogelijk maakt voor hoge resolutie 3D-beeldvorming van embryo’s, visualisatie van vasculaire connectiviteit, en kwantitatieve analyses van PAA-vorming. Dit protocol kan worden gebruikt om te zien hoe genetische veranderingen of milieubeledigingen van invloed paa ontwikkeling. De hier gerapporteerde procedure maakt gebruik van antili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Brianna Alexander, Caolan O’Donnell en Michael Warkala voor het zorgvuldig lezen en bewerken van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de financiering van het National Heart, Lung and Blood Institute van het NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 aan SA; AJR wordt ondersteund door NHLBI HL103920-08S1 en het National Institute of Artritis en Spier- en Huidziekten Training subsidie T32052283-11.
Materials
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
References
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
- Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).
- Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
- Weninger, W., et al. Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).
- Phillips, H. M., et al. Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis. Development. 146 (18), (2019).
- Vlaeminck-Guillem, V., et al. The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
