التصور والتحليل من الشرايين القوس البلعوم ية باستخدام كامل جبل الكيمياء المناعية وإعادة الإعمار 3D
Summary
هنا، نصف بروتوكول لتصور وتحليل الشرايين القوس البلعوم3، 4، و 6 من أجنة الفئران باستخدام كامل جبل الفلورالس، تطهير الأنسجة، المجهر الكونكور، وإعادة الإعمار 3D.
Abstract
تشكيل غير لائق أو إعادة عرض الشرايين القوس البلعوم (PAAs) 3, 4, و 6 تسهم في بعض من أشد أشكال أمراض القلب الخلقية. لدراسة تشكيل PAAs ، قمنا بتطوير بروتوكول باستخدام الفلور المناعة كامل التركيب إلى جانب الكحول البنزيل / البنزوات (BABB) تطهير الأنسجة ، والمجهر confocal. وهذا يسمح لتصور الاندوثيوليوم القوس البلعوم في دقة الخلوية غرامة، فضلا عن اتصال 3D من الأوعية الدموية. باستخدام البرمجيات، وضعنا بروتوكولالتحديد عدد الخلايا الانتوليالية (ECs) في PAAs، فضلا عن عدد ECs داخل الضفيرة الوعائية المحيطة PAAs داخل أقواس البلعوم 3 و 4 و 6. عند تطبيقها على الجنين بأكمله ، توفر هذه المنهجية تصورًا شاملًا وتحليلًا كميًا للخلايا النفاسية الجنينية.
Introduction
أثناء تكوين الجنين بالماوس ، تنشأ شرايين القوس البلعومية (PAAs) كأزواج متناظرة ثنائية الأطراف من الشرايين التي تربط القلب بالأورتاي الظهري1. مع تطور الجنين ، يتراجع أول وثاني أزواج PAAs ، في حين أن 3rdو4th و6 TH PAAs تخضع لسلسلة من أحداث إعادة عرض غير متناظرة لتشكيل الشرايين القوس الأبهري2.
وPAAs 3 و 4 و 6 تطوير عن طريق تكوين الأوعية الدموية، وهو تشكيل دي نوفو من الأوعية الدموية3. عيوب في تشكيل أو إعادة عرض هذه الشرايين القوس تؤدي إلى عيوب القلب الخلقية المختلفة, مثل تلك التي ينظر إليها في المرضى الذين يعانون من متلازمة ديجورج4,5. ولذلك، يمكن أن تؤدي آليات الفهم التي تنظم تطور PAAs إلى فهم أفضل لأمراض القلب الخلقية (CHD).
النهج الحالية لتصور وتحليل تطوير PAA تشمل الفلور المناعي ة من أقسام الأنسجة، يلقي الأوعية الدموية، حقن الحبر الهند، عالية الدقة المجهر episcopic، و / أو كامل جبل المناعيالهيستوكيمياء1،,4،,5،,6،,7. هنا، نحن نصف بروتوكول يجمع بين الفلورالية كامل جبل، المجهر confocal وتقديم صورة 3D من أجل جمع وتحليل وقياس البيانات الحجمية، والاتصال الأوعية الدموية وهوية الخلية. علاوة على ذلك ، نقوم بتفصيل طريقة لتقسيم وقياس أعداد ECs في كل قوس بلعوم كوسيلة لدراسة تشكيل الضفيرة الوعائية القوس البلعومية وإعادة عرضها في PAAs. في حين تم تصميم هذا البروتوكول لتحليل تطوير PAA ، يمكن استخدامه لتحليل شبكات الأوعية الدموية النامية الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وفرت القدرة على تصور البطانة في أجنة الماوس في 3D رؤى جديدة في تطورها3. نقدم هنا بروتوكولًا يسمح بالتصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للأجنة ، وتصور الاتصال بالأوعية الدموية ، والتحليلات الكمية لتشكيل PAA. يمكن استخدام هذا البروتوكول لمعرفة كيف تؤثر التعديلات الوراثية أو الإه?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر بريانا ألكسندر وتساولان أودونيل ومايكل واركالا على القراءة الدقيقة لهذه المخطوطة وتحريرها. وقد دعم هذا العمل بتمويل من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم في المعهد الوطني للصحة العامة R01 HL103920، R01 HL134935، R21 OD025323-01 إلى SA؛ ويدعم AJR من قبل HL103920-08S1 NHLBI والمعهد الوطني لالتهاب المفاصل والعضلات والعظام والأمراض الجلدية منحة التدريب T32052283-11.
Materials
| 10x PBS | MP Biomedicals | PBS10X02 | |
| 20x water immersion objective | Nikon | MRD77200 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories | 1613101 | |
| Alexa Fluor 488 anti-goat | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Invitrogen | A-31570 | |
| Analysis Software | Imaris 9.2.0 | ||
| Benzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 305197 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma-Aldrich | 8.18701.0100 | |
| Cover Slips | VWR | 16004-312 | |
| DAPI (5 mg/mL stock) | Fisher Scientific | D3571 | |
| Eppendorf Tubes (2.0 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Ethanol | VWR | 89370-084 | |
| Falcon tubes (50 mL) | Corning | 352098 | |
| Fast wells | Grace Bio Labs | 664113 | |
| Forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Goat anti-VEGFR2 | R&D Systems, Inc. | AF644 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Microscope | Nikon | A1HD25 | |
| Mouse anti-ERG | Abcam | ab214341 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Petri dishes (35 mm) | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Petri dishes (60 mm) | Genesee Scientific | 32-105 | |
| Plastic Molds | VWR | 18000-128 | |
| Scapels | Exelint International Co. | 29552 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP 151-500 |
References
- Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
- Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).
- Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
- Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
- Weninger, W., et al. Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58 (2018).
- Phillips, H. M., et al. Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis. Development. 146 (18), (2019).
- Vlaeminck-Guillem, V., et al. The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS One. 7 (3), e33916 (2012).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
