Un enfoque basado en microscopía intravital para evaluar la permeabilidad intestinal y el rendimiento del desprendimiento de células epiteliales

El intestino es un órgano altamente especializado con una función estrechamente regulada que permite procesos contradictorios, a saber, nutrición y protección contra sustancias luminales nocivas. Revestimiento entre el cuerpo humano y el medio ambiente, el epitelio intestinal actúa como una barrera física e inmunológica y contribuye al mantenimiento de la homeostasis mucosa en el intestino^1,2. La pérdida de integridad epitelial y el aumento de la permeabilidad de la unión estrecha es bien conocido por estar asociado con la Enfermedad inflamatoria intestinal (IBD)^3,4,5,6. Las alteraciones epiteliales se consideran causas y amplificadores secundarios para la inflamación intestinal crónica en la EII. Por lo tanto, una mejor comprensión de las alteraciones epiteliales tempranas en el intestino de los pacientes con EII sería de gran valor para el desarrollo de nuevas estrategias para restaurar la integridad epitelial para una predicción fiable y la posterior prevención de las recaídas de la EII.

El epitelio intestinal sigue un proceso de rotación complejo y estrictamente regulado. Desde el fondo de la cripta, las células epiteliales intestinales diferenciadas terminalmente (CI) derivadas de células madre pluripotentes migran hacia arriba hasta la punta del villus, donde las células envejecidas/dañadas se arrojan en el lumen^7. El equilibrio entre la división y la extrusión celular permite el mantenimiento de números de células epiteliales intestinales, evitando la formación de huecos y fugas, así como la acumulación de células epiteliales que potencialmente conducen a masas celulares y tumorigenesis^8,,9,,10. A pesar del papel clave del desprendimiento de células epiteliales en la renovación fisiológica del epitelio intestinal, el conocimiento sobre los mecanismos moleculares que impulsan la extrusión de células en la punta del villus es limitado. Por lo tanto, es necesario realizar investigaciones básicas que proporcionen una descripción precisa de la secuencia de eventos moleculares implicados en el desprendimiento de células epiteliales.

Interacciones complejas entre diferentes tipos celulares dentro de la mucosa intestinal son clave para entender los mecanismos moleculares que regulan la rotación epitelial y la homeostasis intestinal. Por lo tanto, los estudios in vivo ofrecen grandes ventajas sobre los enfoques in vitro y ex vivo en este contexto. Además, las técnicas de imagen en tiempo real permiten la descripción de la secuencia de eventos que controlan fenómenos específicos. En este contexto, el estudio de procesos altamente dinámicos exige el uso de técnicas optimizadas de alta resolución para la observación directa del tejido. Las técnicas de imagen intravital aparecen como herramientas únicas adecuadas para el estudio del desprendimiento de células epiteliales en el intestino.

El término “microscopía intravital” se refiere a enfoques experimentales aprovechando las técnicas de imagen de alta resolución (multifotón o microscopía confocal) para visualizar directamente las células y tejidos en sus entornos nativos dentro de un animal vivo¹¹. Permite la adquisición en tiempo real de información in vivo hasta resolución de una sola célula, y implica claras ventajas sobre los métodos estáticos o de baja resolución. La microscopía intravital proporciona información complementaria y supera algunas limitaciones de las técnicas clásicas y/o de alta gama, como los artefactos debido al procesamiento de tejidos. Por el contrario, la principal limitación de la microscopía intravital es que el tejido debe estar expuesto directamente al microscopio, que en la mayoría de los casos requiere cirugía. Aunque los enfoques sofisticados preservan la vitalidad y minimizan el impacto del tejido fotografiado (cámaras de piel y ventanas de imágenes)^12,13, en la mayoría de los casos se realiza una simple incisión cutánea para la externalización del tejido (colgajos de la piel)¹⁴. En la última década, estos enfoques han aportado pruebas clave sobre procesos altamente dinámicos, que antes eran inescrutables. Traslacionalmente, las imágenes en tiempo real proporcionaron nuevos conocimientos biológicos sobre células madre y leucocitos homing¹⁵, así como la diseminación del cáncer y la formación de metástasis^13,16. En el contexto clínico, la endomicroscopía se explota actualmente como una herramienta de diagnóstico del cáncer¹⁷ y enfermedades gastrointestinales, como la EII^18,19; mientras que la microscopía de mosaico confocal se convirtió en una herramienta de patología rápida durante la cirugía²⁰. Juntos, la microscopía intravital ha surgido últimamente como una herramienta valiosa y versátil para la investigación biomédica y la aplicación futura en la clínica.

La microscopía intravital se implementa aquí para la visualización en tiempo real de la fuga epitelial intestinal y la observación de eventos de desprendimiento de células epiteliales. La fuga de permeabilidad intestinal se puede identificar mediante otras técnicas no invasivas in vivo, como la cuantificación de la administración oral de trazadores fluorescentes en el suero^21. Sin embargo, esta técnica no permite la observación directa del rendimiento de desprendimiento ni la segregación entre la permeabilidad para- y transcelular. La combinación de experimentos de trazador estándar y microscopía intravital representa un enfoque adecuado para: i) identificar alteraciones en la permeabilidad intestinal, y ii) segregar entre la permeabilidad epitelial para y transcelular. Además del desprendimiento celular, la microscopía intravital en combinación con el etiquetado de fluorescencia in vivo permite el estudio de otros mecanismos celulares y moleculares (por ejemplo, redistribución de unión estrecha durante el desprendimiento celular utilizando ratones reportero fluorescentes²² o interacciones entre cis y otras células dentro de la mucosa intestinal²³).

El método presentado aquí representa una adaptación de la microscopía intravital para permitir la observación en tiempo real de la mucosa intestinal, utilizando la microscopía de escaneo láser confocal (CLSM). Por lo tanto, utilizamos ratones noqueadores condicionales de GGTase (Geranylgeranyltransferase) en células epiteliales intestinales (IEC) en (Pggt1b^i-CEC ratones), ya que sufren de una enfermedad intestinal grave y aumento de la permeabilidad epitelial²⁴. Se describe la preparación quirúrgica del ratón y la tinción de la mucosa intestinal, así como los ajustes apropiados utilizados para la adquisición de imágenes y el análisis posterior a la adquisición. Este protocolo podría permitir futuros estudios que contribuyan al conocimiento actual sobre la dinámica y la cinética del desprendimiento de células epiteliales intestinales. Además, el protocolo podría servir como base para diversas adaptaciones para estudiar otros fenómenos que ocurren en la superficie de la mucosa intestinal, e incluso en otros tejidos.