Подход, основанный на интравитальной микроскопии для оценки проницаемости кишечника и эпителиальной пролития клеток

Кишечник является высокоспециализированным органом с жестко регулируемой функцией, позволяющей конфликтующие процессы, а именно питание и защита от вредных светящихся веществ. Подкладка между человеческим телом и окружающей средой, кишечный эпителий действует как физический и иммунологический барьер и способствует поддержанию слизистой гомеостаза в^{кишечнике 1,2}. Потеря эпителиальной целостности и повышенная проницаемость плотного соединения, как известно, связаны с воспалительными заболеваниями кишечника (IBD)^3,,4,,5,,6. Эпителиальные изменения затем рассматриваются в качестве причин и вторичных усилителей для хронического воспаления кишечника в IBD. Таким образом, улучшение понимания ранних эпителиальных изменений в кишечнике пациентов IBD будет иметь огромное значение для разработки новых стратегий по восстановлению эпителиальной целостности для надежного прогнозирования и последующей профилактики рецидивов IBD.

Кишечный эпителий следует за сложным и жестко регулируемым процессом оборота. Из склепа дно, неизлечимо дифференцированных кишечных эпителиальных клеток (IECs), полученных из плюрипотентных стволовых клеток мигрируют вверх к кончику виллуса, где в возрасте / поврежденных клеток пролить в люмен⁷. Равновесие между делением и экструзией клеток позволяет поддерживать кишечные эпителиальные числа клеток, избегая образования зазоров и протечек, а также накопление эпителиальных клеток, потенциально ведущих к клеточным массам и опухолевому^{генезу 8,,9,,10.} Несмотря на ключевую роль эпителиального пролития клеток в физиологическом обновлении эпителия кишечника, знания о молекулярных механизмах, вождения экструзии клеток на кончике вилюля ограничены. Таким образом, необходимо продать фундаментальные исследования, обеспечивающие точное описание последовательности молекулярных событий, связанных с эпителиальным пролитием клеток.

Сложные взаимодействия между различными типами клеток в слизистой оболочке кишечника являются ключевыми для понимания молекулярных механизмов, регулирующих эпителиальный оборот и кишечный гомеостаз. Таким образом, исследования in vivo предлагают высокие преимущества перед подходами in vitro и ex vivo в этом контексте. Кроме того, методы визуализации в режиме реального времени позволяют описание последовательности событий, контролирующих конкретные явления. В этом контексте изучение высокодинаминых процессов требует использования оптимизированных методов высокого разрешения для прямого наблюдения за тканями. Интравитальные методы визуализации появляются в качестве уникальных подходящих инструментов для изучения эпителиальных клеток пролить в кишечнике.

Термин “интравитальная микроскопия” относится к экспериментальным подходам, воспользовавшись методами визуализации высокого разрешения (мультифотонная или конфокальная микроскопия) для непосредственной визуализации клеток и тканей в их родных окрестностях в пределах живого^{животного 11}. Это позволяет в режиме реального времени приобретение информации in vivo до разрешения одной ячейки, и влечет за собой явные преимущества по сравнению со статичными или низкими методами разрешения. Интравитальная микроскопия предоставляет дополнительную информацию и преодолевает некоторые ограничения от классических и/или высококачественных методов, таких как артефакты из-за обработки тканей. В отличие от этого, основным ограничением интравитальной микроскопии является то, что ткань должна быть непосредственно подвержена микроскопу, который в большинстве случаев требует хирургического вмешательства. Хотя сложные подходы сохраняют жизнеспособность и минимизируют воздействие изображенной ткани (камеры кожи и окна для^{визуализации) 12,,13,}в большинстве случаев выполняется простой разрез кожи для экстернализации тканей (кожных лоскутов)^14. В последнее десятилетие эти подходы стали ключевыми свидетельствами о высокодинамих процессах, которые ранее были непостижимыми. Переводно, в режиме реального времени изображения предоставили новые биологические идеи о стволовых клетках и лейкоцитов^{самонаведения 15}, а также распространение^{рака и образование метастазов 13,16}. В клиническом контексте эндомикроскопия в настоящее время используется в качестве диагностического^{инструмента рака 17 и} желудочно-кишечных заболеваний, таких как IBD^18,19; в то время как конфокальная мозаичная микроскопия стала инструментом быстрой патологии во время^{операции 20}. В совокупности интравитальная микроскопия в последнее время стала ценным и универсальным инструментом для биомедицинских исследований и будущего применения в клинике.

Интравитальная микроскопия здесь реализована для визуализации эпителиальной утечки кишечника в режиме реального времени и наблюдения за эпителиальными явлениями пролития клеток. Утечка кишечной проницаемости может быть идентифицирована другими неинвазивными методами in vivo, такими как количественная оценка перорального введения флуоресцентных трассировщиков в^{сыворотке 21}. Тем не менее, этот метод не позволяет прямого наблюдения пролить производительность, ни сегрегации между пара- и транс-клеточной проницаемости. Сочетание стандартных экспериментов трассировщика и интравитальной микроскопии представляет собой подходящий подход к: i) выявлению нарушений в проницаемости кишечника и ii) сегрегации между пара- и трансклеточной эпителиальной проницаемостью. Помимо пролития клеток, интравитальная микроскопия в сочетании с маркировкой флуоресценции in vivo позволяет изучать другие клеточные и молекулярные механизмы (например, жесткое перераспределение соединения во время пролития клеток с использованием^{флуоресцентных мышей-репортеров 22} или взаимодействия между IECs и другими клетками внутри слизистой^{оболочки кишечника 23).}

Представленный здесь метод представляет собой адаптацию интравитальной микроскопии для наблюдения слизистой оболочки кишечника в режиме реального времени с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). Таким образом, мы используем условные нокаут мышей GGTase (Geranylgeranyltransferase) в кишечных эпителиальных клеток (IECs) в (Pggt1b^{i qIEC мышей),} так как они страдают от тяжелой кишечной болезни и увеличение эпителиальной проницаемости²⁴. Описана хирургическая подготовка мыши и окрашивание слизистой оболочки кишечника, а также соответствующие настройки, используемые для получения изображений и анализа после приобретения. Этот протокол мог бы позволить будущим исследованиям, способствующим современным знаниям о динамике и кинетике кишечного эпителиального пролития клеток. Кроме того, протокол может послужить основой для различных адаптаций для изучения других явлений, происходящих на поверхности слизистой оболочки кишечника, и даже в других тканях.